響應(yīng)曲面法優(yōu)化裂褶菌多糖的微波輔助提取工藝研究

張雖栓，李延磊，高誠偉

(1.河南質(zhì)量工程職業(yè)學(xué)院，河南 平頂山 467000； 2.云南大學(xué)化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院,云南 昆明 650091)

褶菌多糖(Schizophyllan)是菌體經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)的中性胞外多糖.裂褶菌多糖的結(jié)構(gòu)與分子量的高低與裂褶菌菌種的選擇、培養(yǎng)和發(fā)酵條件的有關(guān)，而多糖的分子量又直接影響了多糖的生物學(xué)活性和開發(fā)前景，在調(diào)節(jié)免疫功能、抗腫瘤、抗輻射等方面有顯著的療效[1、2]，特別是相對分子量在450kD以上的多糖在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用最為廣泛，需求量最大[3、4].目前，對裂褶菌多糖提取工藝的研究主要有酸提取法、熱水浸提法和稀堿提取法等[5～8].微波輻射輔助提取法具有選擇性高、提取時間短、提取率高等優(yōu)點.本研究將微波技術(shù)用于高分子量裂褶菌多糖的提取，組合提取工藝，以期達到提高提取率、減少能耗的目的.

1 材料與方法

1.1材料與試劑

裂褶菌(SchizophyllumcommuneFr.)種由昆明云覃科技開發(fā)有限公司提供.

1.2儀器與設(shè)備

普通恒溫搖床,中國科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠；HZQ-F280全溫度振蕩培養(yǎng)箱，太倉市華美生化儀器廠；UV-2102PC紫外可見分光光度計，德國Bruker公司；2K-82A型真空干燥箱，上海市實驗儀器總廠； 320-S型pH計，METTLER TOLED; AEl00S電子分析天平; Galanz WD700ATL17-3電腦型燒烤微波爐(功率計為700 W).

1.3試驗方法

1. 3.1 培養(yǎng)條件 菌種采用PDA固體培養(yǎng)基，將菌種接種到試管斜面培養(yǎng)基上，于室溫靜置活化3 d，活化好的斜面菌種接入裝有50 mL種子培養(yǎng)基的三角瓶中27 ℃下培養(yǎng)2 d，得到液體菌種；接著將菌種接種到固體培養(yǎng)基27 ℃下培養(yǎng)7～8 d，至菌絲體充滿整個培養(yǎng)基，結(jié)束發(fā)酵過程[9、10].

1.3.2 純度鑒定

1.3.2.1 凝膠柱層析 將Sephadex G-100裝于1.6 cm×20 cm玻璃旋塞柱并平衡，SPG上樣量1 mg，用雙蒸水洗脫，每管收集3 mL，流速0.5 mL·min-1.采用硫酸-苯酚法[11]在490 nm處隔管檢測OD值.

1.3.4 微波提取裂褶菌多糖的提取工藝流程 斜面種子培養(yǎng)—液體菌種接種—固體發(fā)酵培養(yǎng)—干燥—粉碎—微波提取—乙醇沉淀—粗裂褶菌胞外多糖含量測定—粗多糖純化(脫色、脫蛋白)—成品.

1.3.5 裂褶菌多糖得率的測定 裂褶菌多糖含量的測定采用水浸-醇沉法提取測定法，經(jīng)適當(dāng)稀釋后用苯酚-硫酸法測定溶液中多糖含量.裂褶菌多糖提取率計算公式[12]為：

多糖提取率=所得溶液中粗糖含量(mg/mL)×多糖溶液體積(mL)×釋釋倍數(shù)×換算因子/原材料質(zhì)量(mg)×100%

1.4裂褶菌多糖微波提取工藝優(yōu)化

1.4.1 單因素試驗 選取微波強度、提取溫度、料液比、提取時間4個因素作單因素試驗[13].取一定量粉碎的裂褶菌干體，利用微波在微波強度為450～650 W之間，加入料液比(質(zhì)量與體積比)1∶10～1∶35 g·mL-1的蒸餾水， 10～60 ℃的溫度下對裂褶菌多糖進行了5～30 min進行提取，探討其對裂褶菌多糖提取率的影響.

1.4.2 響應(yīng)面優(yōu)化提取條件 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，確定了最佳條件后，以Box-Benhnken中心組合試驗設(shè)計原理進行試驗，設(shè)計了4因素5水平組合試驗優(yōu)化裂褶菌多糖的提取工藝[14].

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1微波提取裂褶菌多糖工藝的優(yōu)化

2.1.1 微波強度對裂褶菌多糖提取率的影響 微波強度對裂褶菌多糖提取率的影響見圖1.從圖1可以看出，在提取時問為30 min，液料比為1∶30 g·mL-1，提取溫度為50 ℃的條件下,隨著微波功率的逐漸提高，裂褶菌多糖提取率不斷增加[15].當(dāng)微波功率達到550 W時，達最大值.再隨功率的增加，多糖提取率變化不明顯，所以選取550 W為最佳功率.

2.1.2 微波提取時間對裂褶菌多糖提取率的影響 提取時間對裂褶菌多糖提取率的影響見圖2.由圖2可知，在10～20 min裂褶菌多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加的最快， 在20 min以后裂褶菌多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)有所增加，但趨勢很慢.根據(jù)提取理論可知，提取時間延長有利于提取得率的提高，但是要考慮實際因素，使成本最低時相對得率最大.綜合提取過程中的每個因素，從節(jié)約能源，降低成本考慮20 min為最佳提取時間.由圖2可知，隨著微波提取時間的增加，裂褶菌多糖的提取率呈上升趨勢.當(dāng)時間達到20 min時，多糖提取率達到最大，所以選取20 min為佳.

圖1 微波強度對裂褶菌多糖提取率的影響

圖2 提取時間對裂褶菌多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.1.3 不同料液比對裂褶菌多糖提取率的影響 不同料液比對裂褶菌多糖提取率的影響見圖3.由圖3可知，多糖提取率隨料液比增加而上升.經(jīng)分析料液比從1∶6 g·mL-1增加到1∶30 g·mL-1多糖提取率顯著上升，而料液比增加到1∶30 g·mL-1以后提取率變化增加不明顯，所以1∶30 g·mL-1為適宜提取料液比.

圖3 不同料液比對裂褶菌多糖提取率的影響

2.1.4 提取溫度對裂褶菌多糖提取率的影響 提取溫度對裂褶菌多糖提取率的影響見圖4.由圖4可知，裂褶菌多糖的提取率隨著溫度的升高在逐漸的提高，溫度在10～50 ℃時，裂褶菌多糖的提取率增加最快，當(dāng)溫度達到50 ℃時，裂褶菌多糖達到最大，60 ℃時，裂褶菌多糖的提取率則降低，可能是裂褶菌多糖在高溫下會發(fā)生裂解，導(dǎo)致它的生物活性降低.綜合整個過程，從節(jié)約能源、降低成本、縮短生產(chǎn)時間考慮，故選擇50 ℃為最佳提取溫度.

圖4 提取溫度對裂褶菌多糖提取率的影響

2.2響應(yīng)面法優(yōu)化裂褶菌多糖的提取工藝

2.2.1 分析因素的選取 根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理[17～19]，結(jié)合單因素試驗結(jié)果，采用響應(yīng)面試驗設(shè)計，以裂褶菌多糖的提取率(Y)做4因素5水平響應(yīng)面試驗設(shè)計，因素及水平設(shè)計如表1，試驗設(shè)計與結(jié)果見表2.

表2 響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析結(jié)果

續(xù)表 Continuing table

2.2.2 模型的建立及其顯著性檢驗

2.2.2.1 試驗設(shè)計及結(jié)果 在單因素的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Design-Expert 7.0軟件對表2試驗數(shù)據(jù)進行擬合分析，，用二次回歸旋轉(zhuǎn)組合試驗統(tǒng)計方法，綜合考慮各個因素對裂褶菌胞外多糖得率的影響，進行多元回歸擬合，得到二次多元回歸方程：

Y=1.89+0.033 1X1+0.013 8X2+0.010 1X3+0.036 5X4-0.074 2X12-0.029 2X22-0.079 6X32-0.055 3X42-0.047 2X1X2+0.005 4X1X3-0.049 7X1X4-0.016 4X2X3-0.018 2X2X4-0.001 0X3X4.

2.2.2.2 二次回歸模型的顯著性檢驗 對上述回歸模型進行方差分析結(jié)果表明(表3)，該模型P值小于0.000 1，失擬項P=0.088不顯著，表明該模型擬合結(jié)果好.由表4可知，除料液比顯著影響(P=0.004)，微波強度(P=0.003 8)具有顯著影響外，其他因素如二次項和交互項對裂褶菌多糖的提取率都有極顯著的影響，數(shù)據(jù)表明具體試驗因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系.各個因素對裂褶菌多糖提取率的影響程度大小順序為：料液比(X2)>微波強度(X4)>提取時間(X1)>提取溫度(X3).由相關(guān)系數(shù)R=0.907，表明該數(shù)學(xué)模型4個因素對產(chǎn)量的影響占90.7%，而其它因素的影響和誤差占9.3%.

表3 回歸模型方差分析

表4 回歸模型系數(shù)顯著性檢驗

2.2.2.3 最佳提取裂褶菌胞外多糖方案 利用回歸方程分別對X1，X2，X3，X4求偏階導(dǎo)數(shù)并令其等于零，解方程組既得X1=0，X2=-0.164 1，X3=0.078 5，X4=-0.030 23.即提取裂褶菌多糖的最佳工藝條件是：提取時間為20 min，料液比為1∶28.5 g·mL-1，提取溫度為51 ℃，微波強度為548 W.

通過軟件分析，當(dāng)裂褶菌多糖產(chǎn)量最高組合為：X1=20 min；X2=1∶28.5 g·mL-1；X3=51 ℃；X4=548 W，即最佳提取工藝為：提取時間為20 min，料液比為1∶28.5 g·mL-1，提取溫度為51 ℃，微波強度為548 W.此條件下，多糖理論提取量為1.78%.為了檢驗所得結(jié)果的可靠性，采用優(yōu)化條件進行提取試驗，實際測得值為1.76%，與理論值相比，0．1%以內(nèi)的相對誤差，因此，響應(yīng)曲面法所得的優(yōu)化條件，裂褶菌多糖提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實用價值.

圖5 料液比與提取時間對裂褶菌多糖提取率的影響

圖6 微波強度與提取時間對裂褶菌多糖提取率的影響

圖7 提取溫度與提取時間對裂褶菌多糖提取率的影響

圖8 提取溫度與料液比對裂褶菌多糖提取率的影響

圖9 微波強度與料液比對裂褶菌多糖提取率的影響

圖10 微波強度與提取溫度對裂褶菌多糖提取率的影響

3 結(jié)論

1)通過單因素試驗，確定了裂褶菌多糖提取的最經(jīng)濟、最適用的范圍，提取時間20 min，料液比為1∶30 g·mL-1，提取溫度50 ℃，微波強度550 W.

2)利用Design-Expert 7.0軟件響應(yīng)面法，建立二次回歸模型方程：Y=1.89+0.033 1X1+0.013 8X2+0.010 1X3+0.036 5X4-0.074 2X12-0.029 2X22-0.079 6X32-0.055 3X42-0.047 2X1X2+0.005 4X1X3-0.049 7X1X4-0.016 4X2X3-0.018 2X2X4-0.001 0X3X4.回歸方程擬合的較好，可以用方程預(yù)測裂褶菌多糖的提取工藝參數(shù).

3)通過計算與驗證得到裂褶菌多糖的最優(yōu)提取工藝條件為：提取時間為20 min，料液比為1∶28.5 g·mL-1，提取溫度為51 ℃，微波強度為548 W.此條件下，多糖理論提取率為1.78%，實際提取率為1.765%，相對誤差為0.1%，預(yù)測值與實際值之間擬合性好.

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