桑葚多糖對小鼠抗疲勞作用及其機制研究

劉 兵

(河南農(nóng)業(yè)大學體育學院，河南 鄭州 450002)

疲勞是指由于身體與精神狀態(tài)的下降而導致的周身疲軟、困乏與精疲力竭之感，是機體復雜的生理生化的綜合反應，可導致機體神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫諸系統(tǒng)調(diào)節(jié)失常[1].運動性疲勞(Exercise-induced fatigue)被看做運動訓練中人體的一種保護性反應機制，是一種生理性疲勞，有別于病理性疲勞[2].運動性疲勞已經(jīng)成為大學生、健身人群和運動員中普遍存在的現(xiàn)象，對其生物學機制的研究已經(jīng)成為各國運動生理工作者不懈努力的課題.開發(fā)安全、有效、無毒副作用抗疲勞食品對于緩解人們生活壓力，促進大眾健身效果和提高運動員的競技運動水平具有重要意義[3].桑葚為多年生?？粕?MorusalbaL.)的成熟果穗.桑葚營養(yǎng)豐富，富含氨基酸、維生素、礦物質(zhì)、黃酮、糖類及生物堿等多種生物活性成分，有“民間圣果”之稱[4].桑葚具有調(diào)節(jié)機體免疫、抑制腫瘤、延緩衰老、降血糖血脂、抗菌抗病毒和抗輻射等生物活性[5].有研究認為其主要活性成分為桑葚多糖(Mulberry amylose，MA)，桑葚多糖具有抗氧化作用和降糖作用[6].綜合國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，對桑葚的研究主要是在產(chǎn)品開發(fā)工藝、抗氧化能力和提高機體免疫力方面，關于桑葚重要功能成分桑葚多糖的抗疲勞作用評價甚少.桑葚作為被衛(wèi)生部正式推出的“藥食同源”作物，研究其抗疲勞作用對于優(yōu)化大眾飲食結構和提高身體健康有重要意義.本研究按照國際通用的抗疲勞研究方法，研究不同糖濃度的桑葚多糖對游泳小鼠的耐力運動時間和運動后血尿氮、乳酸、肝糖原等抗疲勞相關生化指標，旨在為桑葚抗疲勞功能食品研發(fā)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1試驗材料

桑葚購于鄭州市丹尼斯超市.150只雄性昆明種小鼠(許可證號：SCXK 2012-005)購于鄭州大學試驗動物飼養(yǎng)中心， 6～8 周齡，體重18～22 g.

1.2桑葚多糖的制備和試驗動物的飼喂

1.2.1 桑葚多糖的制備 在參考已有其它種類多糖提取方法的基礎上，采用水浸醇析法提取桑葚多糖[4].將100 g新鮮桑葚，剪掉果梗，于60 ℃烘箱進行干燥，粉碎，用150 mL的石油醚回流抽提脫脂，抽濾后涼干.加入150 mL體積分數(shù)為75%的乙醇浸泡過夜，除去黃酮、色素、單糖等，至乙醇提取液接近無色時取出，抽濾回收桑葚渣，涼干.涼干后的桑葚渣以料液比1∶25 加入250 mL重蒸水，置于水浴鍋中，恒溫80 ℃，間歇攪拌，提取4 h.將所得水提液抽濾去除雜質(zhì)，減壓濃縮至原體積的1/3時，加入250 mL體積分數(shù)為95%的乙醇，充分攪拌后放入冰箱靜置過夜沉淀.然后冷凍離心(10 min，12 000 r·min-1)，收集沉淀.如此反復數(shù)次，直到乙醇接近無色，將沉淀涼干，得到桑葚多糖和蛋白質(zhì)的混合物.混合物用少量蒸餾水溶解，加入Sevag試劑(V氯仿∶V正丁醇=1∶4)，充分振蕩20 min，靜置，分離，直到?jīng)]有乳白色凝膠狀蛋白質(zhì)析出為止，收集上清液，60 ℃烘干，得到桑葚多糖.以葡萄糖為對照品，采用苯酚-硫酸法測定MA含量[7].測得粗多糖質(zhì)量分數(shù)為63.7%.將桑葚多糖精確配制成系列濃度的溶液備用.

1.2.2 試驗動物及其分組與飼喂 適應性喂養(yǎng)3 d后，根據(jù)體重將小鼠隨機分為5 組，每組30 只，即正常對照組(NC)、陽性對照組(PC)、低劑量組(LD)、中劑量組(MD)和高劑量組(HD).低劑量組、中劑量組和高劑量組每只小鼠每天灌胃攝入桑葚多糖的劑量依次為：100，300，900 mg·kg-1·d-1.正常對照組小鼠每次每只灌胃0.2 mL生理鹽水，陽性對照組小鼠每次每只灌胃0.2 mL西地那非(Sildenafil)溶液.試驗動物自由采食飲水，飼喂30 d.

1.3動物試驗指標測試及方法

1.3.1 力竭游泳時間的測定 力竭游泳時間的測定按照參考文獻[8]的方法.連續(xù)經(jīng)口給予受試物30 d，小鼠末次給藥30 min后，每只鼠尾根部負小鼠體重5%的鉛皮，放入水溫為28 ℃、水深40 cm的游泳箱中.用加熱棒把水溫控制在28 ℃，并將室溫恒定在25 ℃.用秒表記錄每只小鼠自游泳開始至力竭游泳時間(頭部沉水底10 s為止)，該時間為小鼠的力竭游泳時間.

1.3.2 血清尿素氮含量的測定 參考文獻[8]的方法進行.連續(xù)經(jīng)口給予受試物30 d，于末次給藥30 min后將小鼠放入水溫30 ℃、水深30 cm的游泳箱中，每箱1次放入5 只小鼠，不負重游泳90 min.運動后休息60 min，將眼睛周圍擦干凈，拔眼球取血約0.5 mL，分離血清，用尿素氮試劑盒(購于南京建成生物技術研究所)進行測定.

1.3.3 血乳酸含量的測定 連續(xù)經(jīng)口給予受試30 d，于末次給樣30 min后，將小鼠置于水溫為30 ℃的游泳箱中不負重游泳90 min，每次入水前均將水溫調(diào)至30 ℃，室溫恒定在25 ℃.游泳后拔眼球取血，分離血清，用乳酸試劑盒(購于南京建成生物技術研究所)進行測定.

1.3.4 肝糖原的測定 連續(xù)經(jīng)口給予受試30 d，于末次給樣30 min后，將小鼠置于水溫為30 ℃的游泳箱中不負重游泳90 min，每次入水前均將水溫調(diào)至30 ℃，室溫恒定在25 ℃.游泳后立即處死取肝臟，經(jīng)冰凍生理鹽水漂洗后用濾紙吸干，用肝糖原試劑盒(購于南京建成生物技術研究所)進行測定.

1.4數(shù)據(jù)處理

采用DPS統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)的處理，以平均值 ± 標準差表示，組間顯著性比較采用組間t檢驗，在0.05和0.01水平上進行統(tǒng)計.

2 結果與分析

2.1桑葚多糖對小鼠體重增長的影響

飼喂30 d后，小鼠體重和體重的增加量各組之間比較均無顯著性差異(表1).

2.2桑葚多糖對小鼠力竭游泳時間的影響

與正常對照組相比，各組小鼠的力竭游泳時間均有提高(表2).其中，中劑量組的差異達到顯著水平(P<0.05)，陽性對照組、高劑量組的差異均達到極顯著水平(P<0.01)；與陽性對照組相比，低劑量和中劑量組小鼠力竭游泳時間均極顯著降低(P<0.01)，高劑量組不具有顯著性差異.表明西地那非和桑葚多糖具有延長游泳時間的作用，隨著桑葚多糖劑量的增加，具有明顯的量效關系；并且達到高劑量時，其效果和西地那非相媲美.

表1 桑葚多糖對小鼠體重的影響

2.3桑葚多糖對小鼠肝糖原含量的影響

LD、MD和HD組小鼠的肝糖原含量隨著攝入桑葚多糖劑量的增加而升高，PC組小鼠運動后即刻的肝糖原含量也極顯著高于NC組(表2).與NC組小鼠相比，運動后MD組小鼠肝糖原含量即刻顯著提高(P<0.05)；HD組小鼠的肝糖原含量極顯著提高(P<0.01).與PC組小鼠相比，MD組小鼠的肝糖原含量顯著提高(P<0.05)，但LD組和MD組小鼠均顯著低于PC組(P<0.05).表明西地那非和桑葚多糖具有增加運動小鼠體內(nèi)肝糖原的作用，且隨著劑量的增加，效果越好，高劑量桑葚多糖的攝入優(yōu)于西地那非的作用.

表2 桑葚多糖對小鼠力竭游泳時間、肝糖原含量、血清尿素氮和血乳酸含量的影響

2.4桑葚多糖對小鼠血清尿素氮和血乳酸含量的影響

運動后即刻PC、LD、MD和HD組小鼠的血清尿素氮和血乳酸含量均有降低.與NC組小鼠相比，PC組、HD組小鼠的血清尿素氮與血乳酸含量極顯著降低(P<0.01)，MD組小鼠的血清尿素氮與血乳酸含量顯著降低(P<0.05)，LD組小鼠的血清尿素氮與血乳酸含量有降低，但差異不顯著.與PC組小鼠相比，NC組、LD組小鼠的血清尿素氮與血乳酸含量均極顯著提高(P<0.01)，MD組小鼠的血乳酸含量顯著提高(P<0.05)，HD組小鼠的血清尿素氮與血乳酸含量均差異不顯著.表明西地那非和桑葚多糖均具有降低運動后小鼠體內(nèi)血清尿素氮和血乳酸含量的作用，桑葚多糖高劑量的效果最好，基本與西地那非效果相一致.

3 結論與討論

疲勞是一個涉及許多生理生化因素的綜合性生理過程，是機體腦力或體力活動到一定階段時必然出現(xiàn)的一種正常生理現(xiàn)象，它既標志著機體原有工作能力的暫時下降，又可能是機體處于傷病狀態(tài)的一個先兆[9].合理營養(yǎng)是緩解運動疲勞的重要手段之一，特別是補充能量物質(zhì)、抗氧化劑與一些運動代謝中間介質(zhì)對于延緩疲勞的產(chǎn)生或者加速疲勞的消除具有重要的作用[10].桑葚多糖作為天然的植物多糖提取物，可添加于飲料、果汁、果醬中[11]，方便人們攝入，對其抗疲勞作用的評價不僅有利于桑葚資源的開發(fā)利用，更為體育事業(yè)的發(fā)展起到很好的推動作用.

本研究發(fā)現(xiàn)桑葚多糖的攝入對小鼠的體重沒有影響，與西地那非和正常飲食小鼠相比，體重一直正常，表明在本研究采用的劑量范圍內(nèi)，桑葚多糖的攝入不會具有發(fā)胖或急劇降低體重的作用.力竭游泳時間是運動耐力的最直接體現(xiàn)，更是抗疲勞能力加強的宏觀表現(xiàn)，對評價運動能力具有重要意義[12].從力竭游泳試驗可以發(fā)現(xiàn)，桑葚多糖具有很好的提高小鼠的游泳耐力的作用，并呈明顯的量效關系，特別是高劑量組小鼠的力竭游泳時間比正常組小鼠提高了將近2倍，其效果與現(xiàn)在常用的西地那非效果一致，表明桑葚多糖具有提高運動員耐力和抗疲勞能力的作用.

疲勞產(chǎn)生常伴有血糖濃度的降低，能量物質(zhì)的耗竭被認為是產(chǎn)生疲勞的重要原因之一[8].肝臟和肌肉是機體能量代謝的重要場所，肌、肝糖原儲量和血糖水平直接影響著機體耐運動性疲勞的能力.長時間、大強度運動會導致肌糖元的快速消耗，促使血糖向肌糖元轉化；為維持血糖平衡，大量的肝糖原被分解轉化為血糖[13].因此，更多的肝糖原和肌糖原儲備量，意味著運動時可以為肌纖維收縮提供更多能量，從而延緩運動性疲勞的產(chǎn)生[14].本研究發(fā)現(xiàn)，攝入不同劑量的桑葚多糖均能夠提高小鼠機體糖原的儲備量，特別是高劑量組不僅極顯著的提高了肝糖原儲備量(P<0.01)，而且與陽性對照相比，其效果還要優(yōu)于西地那非.本研究還發(fā)現(xiàn)，不同組間的肝糖原變化趨勢和力竭游泳時間變化趨勢具有一致性，進一步提示桑葚多糖提高肝糖原儲備是其提高機體耐力和抗疲勞作用的原因之一.

血尿素氮是蛋白質(zhì)的代謝產(chǎn)物，在大強度、長時間運動時機體不能通過糖、脂肪分解代謝獲得足夠的能量，骨骼肌中蛋白質(zhì)與氨基酸參與分解代謝供能，產(chǎn)生尿素氮.血清尿素氮是評價機體對運動疲勞的一個重要指標，機體對運動應激的適應能力越差，血清尿素氮增加越明顯，疲勞發(fā)生的越快[15].乳酸是體內(nèi)糖無氧代謝的終產(chǎn)物，肌糖原大量消耗并產(chǎn)生大量乳酸，肌肉和血液中乳酸的逐漸堆積會直接或間接引起肌肉運動能力下降，造成運動性疲勞[16]；乳酸堆積可以降低肌肉和血液的pH值，對神經(jīng)肌肉接點處的興奮傳遞起阻礙作用，抑制磷酸果糖激酶的活性，延緩或中斷無氧糖酵解的反應過程，使ATP合成速度變緩[17]；血液中乳酸含量的降低被認為是抗疲勞的重要指標之一[18].本研究結果顯示，連續(xù)給予小鼠不同劑量的桑葚多糖30 d,在大強度耐力訓練后，中劑量組和高劑量組小鼠的血尿素氮水平與血乳酸含量均顯著低于正常對照組(P<0.05)，說明桑葚多糖具有降低運動后小鼠體內(nèi)的血清尿素氮水平，抑制運動后小鼠血清乳酸升高的作用.

本研究表明桑葚多糖具有明顯的抗疲勞作用.與空白對照相比，高劑量桑葚多糖900 mg·kg-1·d-1能極顯著延長小鼠的力竭游泳時間(P<0.01)，極顯著增加運動后小鼠體內(nèi)肝糖原的儲備量(P<0.01)，極顯著降低運動后小鼠體內(nèi)的血清尿素氮和血乳酸含量(P<0.01).隨著桑葚多糖攝入量的增加，小鼠的抗疲勞效果呈顯著的量效關系，并且高劑量與西地那非效果相一致，表現(xiàn)出很好的抗疲勞功效.

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