磷酸肌酸鈉對離體大鼠肝臟ALT/LDH指標的影響

苑曉燁 王淼 曹經(jīng)琳 曾強 竇劍

肝臟移植是治療終末期肝病的最為有效的方法。但移植術(shù)后相關(guān)并發(fā)癥一直以來困擾著移植醫(yī)生。有研究證實，移植術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生在一定程度上與肝移植供體保存期間組織缺血缺氧及移植后再灌注損傷密切相關(guān)［1－5］。目前低溫缺血保存仍是普遍使用的供肝保存方法，且?guī)缀醵疾捎肬W液保存。有實驗證實，在離體腎臟UW液中添加多種非灌注液中常規(guī)存在的藥物，可對器官的保存產(chǎn)生積極的影響，延長保持時限，同時明顯改善移植后腎臟功能恢復［4］。磷酸肌酸(creatine phosphate，CP)是一種高能磷酸化合物，是體內(nèi)高能磷酸基的暫時貯存形式。通過肌酸激酶的作用，可以供給ADP磷酸基以維持正常的ATP水平。而ATP是任何細胞代謝過程中最主要的能量源。本研究應用含不同濃度磷酸肌酸鈉的UW灌注液對離體大鼠肝臟灌注后進行冷保存，檢測冷保存期間不同時間點離體大鼠肝臟ALT/LDH指標變化，分析其意義并探索合適的磷酸肌酸鈉應用劑量。

1 材料與方法

1.1 材料 選用Wister系雄性大鼠40只，隨機分為對照組(單純UW液灌注肝臟)10只;低劑量組(以UW液為基液加入磷酸肌酸鈉，濃度為1 g/100 ml灌注肝臟)10只;中劑量組(以UW液為基液加入磷酸肌酸鈉，濃度為2 g/100 ml灌注肝臟)10只;高劑量組(以UW液為基液加入磷酸肌酸鈉，濃度為3 g/100 ml灌注肝臟)10只。動物實驗方法符合動物倫理學要求。

1.2 試劑 UW液購自百時美施貴寶公司，HCA液(離體腎保存用枸櫞酸鹽嘌呤溶液)購自上海長征醫(yī)院注射用磷酸肌酸鈉購自海口奇力制藥有限公司，乳酸脫氫酶(LDH)測試盒及谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測試盒購自南京建成生物工程研究所

1.3 方法 動物模型制備:采用大鼠肝臟單純冷保存離體灌注模型，大鼠術(shù)前采用10%水合氯醛以0.3 ml/100 g經(jīng)腹腔麻醉，取腹部“十”字形切口進入腹腔，分離腹主動脈，經(jīng)腹主動脈插管，灌注4℃HCA液20 ml，經(jīng)門靜脈插管，對照組灌注單純4℃UW液，實驗組分別根據(jù)組別灌注以4℃含不同濃度磷酸肌酸鈉的UW液，行供肝原位低壓重力灌洗(灌洗量20 ml)，同時剪開大鼠心臟建立流出道，灌注至肝臟顏色變淡呈均勻土黃色完整切取肝臟，實驗組供肝置于與灌注肝臟所用的相同濃度含磷酸肌酸鈉的4℃的UW液中，對照組供肝為4℃單純UW液保存。指標測定:取由肝下下腔靜脈留取的保存液樣本，經(jīng)最佳取樣摸索及標準曲線畫定后，采用比色法，應用可見光分光光度計測定各樣本的吸光度值(OD值)，根據(jù)計算公式計算ALT及LDH活性。

1.4 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，計量資料之間比較采用單因素方差分析;Mann-Whitney U檢驗比較兩樣本頻數(shù)資料，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ALT不同時間點4組含量 肝下下腔靜脈內(nèi)的保存液中ALT不同時間點4組含量，與對照組比較，實驗組肝臟經(jīng)過12 h冷保存后肝下下腔靜脈內(nèi)的保存液中ALT含量均小于對照組(P＜0.05)，但高劑量組在經(jīng)過24 h冷保存后，保存液中ALT含量大于對照組及中劑量、低劑量組(P＜0.05)。見表1。

表1 4組不同時間點ALT含量比較n=，U/L，±s

表1 4組不同時間點ALT含量比較n=，U/L，±s

注:與對照組比較，*P ＜0.05;與低劑量組比較，#P ＜0.05;與中劑量組比較，△P ＜0.05

組別0 h 6 h 12 h 18 h 24 h對照組 46.52 ±1.52 53.05 ±2.68 63.66 ±3.15 64.48 ±1.31 73.81 ± 2.01低劑量組 45.66 ±2.25 51.58 ±1.52 58.49 ±1.85* 64.89 ±3.57 71.25 ±2.29中劑量組 45.29 ±2.09 51.72 ±1.65 58.52 ±1.79* 65.47 ±2.23 71.65 ±1.78高劑量組 46.09 ±1.57 52.45 ±1.55 58.93 ±3.26* 66.18 ±4.38 75.65 ±5.06*#△

2.2 LDH不同時間點4組含量 肝下下腔靜脈內(nèi)的保存液中LDH不同時間點各組含量，與對照組比較，實驗組肝臟經(jīng)過12 h冷保存后肝下下腔靜脈內(nèi)的保存液中LDH含量均小于對照組(P＜0.05)。余各組之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表2。

表2 4組不同時間點LDH含量n=10，U/L，±s

表2 4組不同時間點LDH含量n=10，U/L，±s

注:與對照組比較，*P ＜0.05

組別0 h 6 h 12 h 18 h 24 h對照組 1 640.59 ±102.44 1 916.30 ±93.56 2 272.07 ±102.58 2 548.53 ±107.59 2 809.29 ±99.17低劑量組 1 653.37 ±115.06 1 889.75 ±84.37 2 164.77 ±86.01* 2 458.22 ±147.13 2 735.09 ±95.86中劑量組 1 590.96 ±108.71 1 883.55 ±102.69 2 171.52 ±87.47* 2 433.56 ±131.21 2 767.16 ±164.61高劑量組 1 663.63 ±86.82 1 997.20 ±104.45 2 173.95 ±60.18*2 500.76 ±70.30 2 779.28 ±62.23

3 討論

肝移植術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)病因素較為復雜。研究證實，其與供肝保存期間組織缺血缺氧及移植后再灌注損傷密切相關(guān)［1－3］。缺血/再灌注損傷涉及許多復雜級聯(lián)反應的病理生理過程。其中包括中性粒細胞、血小板、細胞因子、活性氧、活性氮、凝血系統(tǒng)以及谷胱甘肽還原酶等因素的激活。最終引起細胞損傷、死亡、組織壞死最終導致多器官功能不全。

CP是一種高能磷酸化合物，體內(nèi)高能磷酸基的暫時貯存形式，是人體重要的能量供應源。CP可明顯改善微循環(huán)供血，為細胞的有氧氧化提供能量［5］。外源性CP能被機體組織迅速吸收，直接釋放高能磷酸鍵合成ATP，迅速補充機體能量，保護細胞結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定細胞膜，增加缺氧組織對氧的利用，減輕缺氧組織的損傷［6］心臟外科中應用外源性CP作為能量基質(zhì)加入心臟停搏液中灌注心肌，能使缺血心肌細胞內(nèi)能量得到補充，線粒體及細胞膜功能得到維護，避免無氧代謝的損害，從而加強心臟停搏液對心肌細胞的保護作用。

ALT及LDH是檢測肝功能的常用指標，肝細胞壞死時ALT升高，其升高的程度與肝細胞受損的程度相一致，因此是目前最常用的肝功能指標。LDH是廣泛存在的催化乳酸和丙酮酸相互轉(zhuǎn)換的一種糖酵解酶。LDH存在于機體所有組織細胞的胞質(zhì)內(nèi)，幾乎存在于所有組織中。本實驗結(jié)果顯示，肝下下腔靜脈內(nèi)的保存液中隨著冷保存時間延長，各組ALT、LDH含量逐漸增加，在6～12 h期間，對照組較各實驗組 ALT、LDH含量增加明顯，以12 h時間點差別最為明顯，與對照組比較，實驗組肝臟經(jīng)過12 h冷保存后肝下下腔靜脈內(nèi)的保存液中ALT、LDH含量均小于對照組(P＜0.05)。分析其原因可能因?qū)嶒灲M添加了磷酸肌酸鈉以提供冷保存期間的能量，增加內(nèi)源性超氧化物歧化酶活性，有效清除氧自由基，減低肝組織脂質(zhì)過氧化反應有關(guān)。但在保存時間終點即24 h時，高劑量組中ALT含量明顯高于對照組以及其他實驗組。高劑量組考慮該結(jié)果與藥物濃度過大，因此增加了長時間冷保存的肝臟組織破壞有關(guān)。

在目前各移植中心，多種因素導致供肝無法短時間內(nèi)移植入受體。其中包括供體的運輸時間、移植患者因某些因素未充分完成術(shù)前準備、手術(shù)摘除病肝困難等。因此，延長供肝保存時限，減少供肝組織缺血損傷，降低供肝血流開放后的缺血再灌注損傷，成為亟待解決的問題。本實驗表明，磷酸肌酸鈉對離體肝臟冷保存有較好的保護作用，其保護移植肝臟的機制可能與減輕能量代謝障礙，降低氧自由基損傷兩個方面作用有關(guān)，從而減輕了肝細胞膜脂質(zhì)過氧化損傷，穩(wěn)定細胞膜，減輕再灌注時的肝臟損傷。尤其對于經(jīng)過12 h冷保存后的肝臟具有有效的保護作用，但無法延長最終即24 h冷保存后肝臟的質(zhì)量。通過本實驗研究結(jié)果提示磷酸肌酸在供肝保存中可能有較好的應用前景，但本研究尚處于動物試驗階段，將其應用于臨床供肝的保存以及成人供肝灌注及保存液中磷酸肌酸鈉的用藥濃度還有待于進一步研究。

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