托吡酯致小鼠胚胎毒性及葉酸干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究

鄭麗娜 李云霞 闞淑娟 王春艷

癲癇是一組由大腦神經(jīng)元突然異常放電所引起的短暫大腦功能失調(diào)的慢性綜合征，具有突然、反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)［1］。癲癇是妊娠期女性需要持續(xù)治療的最常見神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?］。癲癇女性妊娠期間的病情往往比未妊娠期加重，死胎或新生兒死亡的發(fā)生率升高，早產(chǎn)兒和畸形兒的發(fā)生率增加，孕產(chǎn)婦的死亡更加常見［3－5］。我國(guó)每年有(3～4)/萬(wàn)的新生兒來自患有癲癇疾病的母親，癲癇孕婦后代畸形發(fā)生率高于正常女性的2～3倍［1］。抗癲癇藥物(AEDs)是目前治療癲癇最常用和最重要的手段，其安全性越來越受到廣泛的關(guān)注。有研究表明，所有的AEDs均具有不同程度的致畸作用［6］。新一代抗癲癇藥托吡酯(TPM)以其多重的藥理作用在臨床實(shí)踐中表現(xiàn)出明顯的治療效果［7］，但其對(duì)胚胎的發(fā)育是否有毒性作用無(wú)相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以小鼠為研究對(duì)象，觀察TPM的胚胎毒性作用及葉酸(folic acid，F(xiàn)A)的干預(yù)效應(yīng)，從而為臨床上服用TPM的生育期女性安全用藥提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級(jí)昆明種小鼠，由北京華阜康生物科技股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。合格證號(hào):SCXK(京)2009-0004。雌性體重(21.8 ±1.7)g，雄性體重(22.6 ±1.8)g，自然光照，自由飲水進(jìn)食，適應(yīng)性飼養(yǎng)七天。TPM(西安楊森制藥有限公司，25 mg/片，批號(hào):090724035)，F(xiàn)A(北京北大藥業(yè)有限公司，每片0.4 mg，批號(hào):S090528);兩種藥物用蒸餾水配制成所需濃度。

1.2 動(dòng)物分組及給藥 按雌雄比例2∶1合籠交配，次日清晨定時(shí)檢查雌鼠陰栓，以查見陰栓者為妊娠零天，并隨機(jī)分為5組，每組20只孕鼠。分別為:(1)空白對(duì)照組:每天灌胃蒸餾水，容量為10 ml·kg－1·d－1;(2)TPM 低劑量組:40 mg·kg－1·d－1經(jīng)口灌胃;(3)TPM 高劑量組:80 mg·kg－1·d－1經(jīng)口灌胃;(4)TPM低劑量 +FA 組:TPM40 mg·kg－1·d－1經(jīng)口灌胃，同時(shí)添加 0.7 mg·kg－1·d－1FA;(5)TPM 高劑量 +FA組:TPM80 mg·kg－1·d－1經(jīng)口灌胃，同時(shí)添加0.7 mg·kg－1·d－1FA［5 組給藥劑量均相當(dāng)于成人等效劑量的10倍(成人按60 kg)］。5組小鼠于分組后第2天，雌鼠開始給藥，直至妊娠結(jié)束。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察小鼠給藥后狀態(tài)，對(duì)孕鼠于妊娠第22天處死，檢查子宮內(nèi)胚胎數(shù)及其發(fā)育狀況。記錄孕鼠體重，著床數(shù)、活胎數(shù)、死胎數(shù)、吸收胎數(shù)。測(cè)量仔鼠的體重、身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)等。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用Instat統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)孕鼠生殖能力影響 與空白對(duì)照組相比較，用的4組著床數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。TPM低劑量組活胎率、吸收胎率和死胎率與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。TPM高劑量組和TPM高劑量+FA組與空白對(duì)照組比較活胎率顯著降低、吸收胎率和死胎率明顯升高(P＜0.01)，TPM高劑量組與TPM高劑量+FA組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 藥物對(duì)孕鼠生殖能力的影響 n=20，只(%)

2.2 對(duì)胎鼠生長(zhǎng)發(fā)育的影響 與空白對(duì)照組相比較，TPM低劑量組、TPM高劑量組與TPM高劑量+FA組胎鼠體重、身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，TPM低劑量+FA組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。TPM低劑量組與TPM低劑量+FA組相比較，胎鼠體重、身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表2。

表2 藥物對(duì)胎鼠生長(zhǎng)發(fā)育的影響n=20，±s

表2 藥物對(duì)胎鼠生長(zhǎng)發(fā)育的影響n=20，±s

注:與空白對(duì)照組比較，*P ＜0.01;與TPM的劑量組比較，#P ＜0.01

組別 胎鼠體重(g) 胎鼠身長(zhǎng)(cm) 胎鼠尾長(zhǎng)(cm)空白對(duì)照組1.57 ±0.08 2.39 ±0.13 1.17 ±0.06 TPM 低劑量組 1.21 ±0.07* 2.01 ±0.15* 1.01 ±0.09*TPM 高劑量組 1.09 ±0.04* 1.87 ±0.28* 0.98 ±0.07*TPM 低劑量 +FA 組 1.48 ±0.09# 2.15 ±0.27# 1.10 ±0.05#TPM 高劑量 +FA 組 1.22 ±0.06* 2.05 ±0.17* 1.02 ±0.04*

2.3 對(duì)胎鼠畸形方面的影響 與空白對(duì)照組相比較，TPM高劑量組畸形數(shù)明顯升高(P＜0.01)，其余組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。TPM高劑量組與TPM高劑量+FA組相比較畸形數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，畸形類型主要表現(xiàn)為唇腭裂、小頭、脊膜膨出、短肢等。見表3。

表3 藥物對(duì)胎鼠畸形方面的影響 n=20

3 討論

通過本研究發(fā)現(xiàn)TPM高劑量對(duì)小鼠的生殖能力有明顯的毒性影響，補(bǔ)充FA并不能有效拮抗這種毒性作用。TPM低劑量對(duì)妊娠期小鼠的生殖毒性作用較小。有報(bào)道證實(shí)，幾乎所有的藥物大劑量應(yīng)用均能影響胚胎的發(fā)育［8］。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了藥物對(duì)生殖方面的毒性與劑量相關(guān)。TPM高、低劑量對(duì)胎鼠的生長(zhǎng)發(fā)育均有影響，補(bǔ)充FA能有效干預(yù)低劑量TPM的影響，但對(duì)高劑量TPM無(wú)明顯干預(yù)作用。高劑量TPM致畸作用明顯，補(bǔ)充FA能有效的拮抗致畸作用。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)TPM對(duì)小鼠的生殖能力、生長(zhǎng)發(fā)育及致畸性均有影響，高劑量尤其明顯，妊娠期及時(shí)補(bǔ)充FA能起到有效的干預(yù)作用。

全世界約有1 800萬(wàn)癲癇女性［9］，癲癇育齡期女性在發(fā)作完全控制或控制較好的情況下，要求妊娠的意愿明顯增強(qiáng)，因此前瞻性地研究癲癇女性妊娠期用藥的安全性以及胎兒先天性畸形的情況就顯得尤為重要。目前認(rèn)為，AEDs有多種致畸機(jī)制，而其導(dǎo)致FA代謝障礙是較明確的一種。妊娠期間服用AEDs導(dǎo)致母體及胎兒體內(nèi)的 FA水平降低，干預(yù)胚胎的外胚層分化，使神經(jīng)管畸形的發(fā)生率升高［10］。癲癇孕婦與正常孕婦比較生育低體重兒和早產(chǎn)兒的幾率明顯升高，這與本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合。

TPM是一種新型、高效的抗癲癇藥物，1980年首次在實(shí)驗(yàn)室中合成，6年后開始用于治療癲癇患者，1995年正式在英國(guó)上市，1999年獲準(zhǔn)在我國(guó)上市使用［11］。它主要應(yīng)用于單純部分發(fā)作、復(fù)雜部分性發(fā)作和全身強(qiáng)直陣攣性發(fā)作，尤其對(duì)Lennox-Gastaut綜合征和West綜合征具有較好療效。它具有阻斷鈉通道與GABA-A受體相通作用，也具有拮抗FA代謝的藥理作用。該藥能誘導(dǎo)胚胎甲酰四氫葉酸水平下降，從而引起胚胎細(xì)胞分裂異常，導(dǎo)致胚胎停止發(fā)育、宮內(nèi)發(fā)育遲緩、流產(chǎn)、畸胎等異常妊娠情況［12］。

FA是由蝶啶、谷氨酸和對(duì)氨基苯甲酸組成的B族維生素，是細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂所必需的重要物質(zhì)［13］。它參與體內(nèi)一碳單位的轉(zhuǎn)移和代謝，對(duì)DNA和RNA的合成以及細(xì)胞增殖和組織分化具有重要意義［14］，在核酸、蛋白合成及氨基酸轉(zhuǎn)化過程中也起著重要作用。FA缺乏可引起胎兒神經(jīng)管發(fā)育缺陷，影響胎兒發(fā)育［15］。人類自身不能合成 FA，必須依賴食物供給。FA廣泛存在于動(dòng)、植物性食品中，以水果、蔬菜和肉中含量較高。FA易迅速氧化為不可利用的形式，因而在烹調(diào)過程中易被破壞［16］。成人FA日需要量為50～100 μg，而妊娠期女性為滿足胎兒生長(zhǎng)發(fā)育每天需要量為400～500 μg［17］。妊娠期女性低血清 FA 濃度會(huì)對(duì)妊娠期女性及胎兒造成多種不良影響。我國(guó)從20世紀(jì)80年代末期開始，全國(guó)各地區(qū)推廣服用FA增補(bǔ)劑，已經(jīng)有效地降低了神經(jīng)管畸形的發(fā)生，使高發(fā)地區(qū)預(yù)防率達(dá)到85%，低發(fā)地區(qū)預(yù)防率達(dá)到40%［18］。

由于存在種間差異，同一致畸物在不同物種和同一物種的不同品系動(dòng)物的代謝過程有一定差異，不同物種動(dòng)物胚胎構(gòu)造也不盡相同。因此，對(duì)小鼠的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果不能說明對(duì)人體的等同作用，需要進(jìn)一步的深入研究和人群流行病學(xué)調(diào)查。

1 陳灝珠主編.實(shí)用內(nèi)科學(xué).第12版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2006.2705.

2 楊寧，黎冰梅，劉曉蓉，等.抗癲癇藥物及其他危險(xiǎn)因素對(duì)妊娠癲癇婦女及胎兒的影響.國(guó)際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報(bào)，2010，16:385-388.

3 Barrett C，Richens A.Epilepsy and pregnancy:report of an Epilepsy Research Foundation workshop.Epilepsy Res，2003，52:147-187.

4 Tatum WO，et al.Updates on the treatment of epilepsy in women.Arch Intern Med，2004，164:137-145.

5 Anonymous.Antiepileptics，pregnancy and the child.Drug Ther Bull，2005，43:13-16.Correction.ibid;72.

6 Arpino C，Brescianini S，Robert E，et al.Teratogenic effects of antiepileptic drugs:use of an international database on malfonnations and drug exposure(MADRE).Epilepsia，2000，41:1436-1443.

7 羅聰，任榕娜，胡渝華，等.抗癲癇藥妥泰對(duì)大鼠胚胎骨骼發(fā)育影響的研究.中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志，2003，11:11-13.

8 Polifka JM，F(xiàn)riedman JM.Medical genetics:Clinical teratology in the age of genomics.CMAJ，2002，167:265-273.

9 Thomas SV，Sindhu K，Ajaykumar B，et al.Maternal and obstetric outcome of women with epilepsy.Seizure，2009，18:163-166.

10 陳榆，畢桂南.癲癇婦女生殖健康的影響因素研究.國(guó)際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志，2012，39:72-75.

11 王濤.托吡酯不良反應(yīng)文獻(xiàn)分析.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2008，28:1230-1231.

12 Hemandez-Diaz S，Werler MM，Walker AM，et al.Folicacid antagonists during pregnancy and the risk of birth defect.N Engl J Med，2000，343:1608-1614.

13 毛康娜，李丹丹，周鈺.北京市海淀區(qū)孕產(chǎn)婦增補(bǔ)葉酸現(xiàn)狀分析.中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志，2013，21:80-81.

14 霍曉溪，王心，尚麗新.葉酸對(duì)妊娠期鄰苯二甲酸二酯暴露致孕鼠及其胚胎損傷的防治作用.山東醫(yī)藥，2012，52:10-12.

15 孫紹春.補(bǔ)充葉酸對(duì)妊娠期高血壓疾病的影響.河北醫(yī)藥，2010，32:2030-2031.

16 希恩.C.斯威曼主編.馬丁代爾藥物大典.第35版.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2009.1560.

17 Rayburn WF，Stanley JR，Garrett ME.Periconceptional Folate intake and neural tube defects.J Am Coll Nutr，1996，15:121.

18 Zhu L，Ling H.National neural tube defects prevention Programin China.Food Nutr Bull，2008，29:S196-201.