東北地區(qū)擬南芥室內(nèi)栽培技術(shù)

戚曉利，趙樹(shù)堂，韓誠(chéng)武，張麗敏，張海軍，申 健，王 波

(1.佳木斯大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，佳木斯 154007；2.林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院，北京 100091)

擬南芥(Arabidopsisthaliana)屬十字花科植物，又名鼠耳芥、阿拉伯芥、阿拉伯草。它具有植株矮小、生長(zhǎng)周期短、結(jié)籽多、生活力強(qiáng)、基因組小等特點(diǎn)[1]，作為遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究的模式生物之一，尤其在植物發(fā)育生物學(xué)研究中扮演了十分重要的角色，被國(guó)內(nèi)外許多實(shí)驗(yàn)室廣泛種植。目前國(guó)內(nèi)很少有實(shí)驗(yàn)室具備國(guó)外標(biāo)準(zhǔn)化人工氣候室，如何在簡(jiǎn)陋條件下培養(yǎng)成為國(guó)內(nèi)外許多實(shí)驗(yàn)室面臨的問(wèn)題。2011年本課題組承擔(dān)了國(guó)家科研院所公益基金合作項(xiàng)目，將胡楊BIBAC文庫(kù)中的基因大片段轉(zhuǎn)入擬南芥，由于東北地區(qū)干燥寒冷的氣候特點(diǎn)，擬南芥的培養(yǎng)遇到各種問(wèn)題，影響科研工作的進(jìn)展。因此，本研究結(jié)合東北地區(qū)的實(shí)驗(yàn)條件和氣候特點(diǎn)，主要在擬南芥的播種方法、溫度、光照條件、病蟲(chóng)害防治等方面進(jìn)行了探索改進(jìn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室栽種的長(zhǎng)期實(shí)踐總結(jié)出一套適合東北寒冷氣候特點(diǎn)的擬南芥培養(yǎng)方法，供同行參考。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥種子(ArabidopsisthalianaColumbia)由中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供、MS培養(yǎng)基、培養(yǎng)基質(zhì)(營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石=1∶1)、1/2MS營(yíng)養(yǎng)液。

1.2 方法

土壤育苗法：取育種盤(pán)裝培養(yǎng)基質(zhì)(營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石=1∶1)約4 cm厚，加水使土壤充分吸水濕透，取擬南芥種子，直接播撒在土壤表面。播種后覆蓋薄膜保濕(薄膜上扎孔利于通氣)，放入培養(yǎng)室進(jìn)行人工光照培養(yǎng)。當(dāng)2片子葉完全伸展時(shí)，去除其上覆蓋的薄膜，于2片真葉期移栽。

基質(zhì)育苗法：將種子消毒后撒播于無(wú)菌MS培養(yǎng)基內(nèi)，光照培養(yǎng)，2片真葉期移栽到培養(yǎng)基質(zhì)中。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)方法的比較

培養(yǎng)基質(zhì)是擬南芥生長(zhǎng)中的關(guān)鍵因素，蛭石質(zhì)地疏松，通氣性好，利于幼苗生根。為了保證提供充足的營(yíng)養(yǎng)與良好的通氣透水性，將蛭石、營(yíng)養(yǎng)土按1∶1的比例混勻[2]。培養(yǎng)基質(zhì)裝盆時(shí)，選用干基質(zhì)要優(yōu)于濕基質(zhì)，可避免裝盆時(shí)培養(yǎng)基質(zhì)的黏結(jié)，保證培養(yǎng)基質(zhì)的通透性而利于扎根。干基質(zhì)裝入塑料缽后，將塑料盆放入盛有水的平底塑料托盤(pán)中，采用底盤(pán)吸水法讓水分通過(guò)毛細(xì)管作用由下至上順著塑料盆底部的小孔自然滲入培養(yǎng)基質(zhì)中，吸透水后將塑料托盤(pán)內(nèi)多余水倒出，即可進(jìn)行移栽。幼苗移栽后因環(huán)境條件的變化，需經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的緩苗期才能正常生長(zhǎng)。移栽時(shí)選擇壯苗(株型矮壯，葉色深綠，大小整齊)移栽。土壤育苗法移栽時(shí)要多帶護(hù)根土，避免損傷根系而影響其成活率?；|(zhì)育苗法移栽時(shí)將根部附帶的培養(yǎng)基水洗干凈再移入培養(yǎng)基質(zhì)中，每株擬南芥占約5 cm2空間即可。移栽時(shí)擬南芥的苗齡對(duì)其成活率有很大影響，故要做到適時(shí)移栽。最好選擇陰天或傍晚時(shí)分移栽，移栽后蓋膜緩苗2 d，去除薄膜正常培養(yǎng)。

基質(zhì)培養(yǎng)法與土壤培養(yǎng)法相比較而言，基質(zhì)培養(yǎng)法保證了出苗的一致性，生長(zhǎng)周期略短，缺點(diǎn)是幼苗在移栽到土壤后，對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性差，前期種子的消毒，培養(yǎng)基的配置要求無(wú)菌操作，增加了工作負(fù)擔(dān)。

可根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體情況擇優(yōu)選擇。本課題以轉(zhuǎn)基因?yàn)槟康膶?shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)化后需要利用抗生素進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株篩選，此時(shí)優(yōu)選基質(zhì)培養(yǎng)法，將作為對(duì)照的野生型擬南芥直接移入土壤中培養(yǎng)，既節(jié)時(shí)又省力。

2.2 播種

擬南芥種子表面甚至內(nèi)部帶有病菌，將直接傳給幼苗和成株，造成病害發(fā)生，所以播前進(jìn)行種子消毒對(duì)提高播種質(zhì)量，培育無(wú)病灶苗具有重要意義[3]。種子消毒常用方法有藥粉拌種、藥液浸種。本實(shí)驗(yàn)選用轉(zhuǎn)基因植株篩選的種子滅菌法，在超凈工作臺(tái)中將種子至于滅菌的濾紙上，噴灑70%的酒精浸種10 min，噴灑無(wú)水酒精，酒精揮發(fā)后將一部分種子收集到Eppendorf管中備用，一部分播于MS培養(yǎng)基中作為篩選轉(zhuǎn)基因植株的對(duì)照。此方法可避免采用殺菌劑對(duì)環(huán)境的污染和人體的危害，又與后期轉(zhuǎn)基因篩選實(shí)驗(yàn)密切相結(jié)合，減少工作量。收獲的種子干燥后一般置于4 ℃冰箱內(nèi)保存，在此條件下保存一個(gè)月以上的種子可不必低溫處理，直接用于播種[4]。

2.3 培養(yǎng)條件

2.3.1 溫度

擬南芥不耐高溫，最適溫度在(22±2) ℃。溫度過(guò)高則擬南芥長(zhǎng)勢(shì)弱，生殖期提前，還易引發(fā)各種病蟲(chóng)害，溫度過(guò)低則生長(zhǎng)發(fā)育周期延長(zhǎng)。夏季時(shí)期要特別注意避免斷電或空調(diào)故障而使溫度長(zhǎng)時(shí)間失控。本課題組培養(yǎng)室在4～10月份主要依靠空調(diào)控溫，黑龍江的冬季(11～3月)室外溫度低，主要采取集中供暖，白天室內(nèi)溫度約15 ℃，夜間溫度為8 ℃左右，低溫對(duì)擬南芥的培養(yǎng)提出挑戰(zhàn)。試驗(yàn)比較了擬南芥在人工光照(白色熒光燈，16 h光照8 h黑暗，光照強(qiáng)度70 μmol/m2s)條件下二種溫度土培擬南芥的生長(zhǎng)情況(表1)。由表1可以看出，11～3月份播種的擬南芥植株，始花時(shí)間、蓮座直徑、植株總高、生長(zhǎng)周期等指標(biāo)均高于4～10月份，植株葉片顏色深綠，花序高而粗，植株健壯，果莢大、種子飽滿。這是因?yàn)闅鉁氐停瑺I(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)旺盛，利于培養(yǎng)轉(zhuǎn)化用苗。缺點(diǎn)是生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，延長(zhǎng)了實(shí)驗(yàn)周期。擬南芥培養(yǎng)溫度總體掌握的原則是“寧低勿高”，可以根據(jù)不同的試驗(yàn)?zāi)康暮腿〔男枰?，進(jìn)行分期播種。只要嚴(yán)格掌握春化、播種、育苗、移栽、管理一整套的栽培技術(shù)，成活率均可達(dá)95%。

表1 擬南芥的生長(zhǎng)情況

2.3.2 濕度

擬南芥喜濕潤(rùn)，生長(zhǎng)環(huán)境的空氣相對(duì)濕度比較高時(shí)有利于擬南芥生長(zhǎng)。本培養(yǎng)室的條件達(dá)不到其對(duì)濕度的要求，保濕方法主要是在地面潑水并不定期噴霧小苗的方法增加濕度。

2.3.3 光照

根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度和光照時(shí)間。擬南芥屬長(zhǎng)日照植物，光照強(qiáng)度大和光照時(shí)間長(zhǎng)，可以促進(jìn)生殖生長(zhǎng)，縮短收獲種子的時(shí)間[5]。植物生長(zhǎng)燈均有獨(dú)立開(kāi)關(guān)，光照強(qiáng)度可通過(guò)開(kāi)關(guān)燈管數(shù)量控制。本室冬季一般采用16 h光照和8 h黑暗條件培養(yǎng)擬南芥，或者根據(jù)需要增加光照時(shí)間、光照強(qiáng)度以縮短生長(zhǎng)周期。夏季時(shí)先將植物置于8 h光照和16 h黑暗的短光照條件下培養(yǎng)(從移苗開(kāi)始約需4 周)，再移至長(zhǎng)光照下誘導(dǎo)開(kāi)發(fā)，以促進(jìn)植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)。植物轉(zhuǎn)化完后，可在24 h光照條件下培養(yǎng)，促進(jìn)種子的成熟。光照除選用植物生長(zhǎng)燈外，適當(dāng)補(bǔ)充黃色光源，利于植物生長(zhǎng)。

2.3.4 肥水管理

擬南芥耗水強(qiáng)度隨生育進(jìn)程而改變，耗水量以苗期最大，果期最少。澆水原則是“不干不澆，澆則澆透”。切忌過(guò)量灌水，避免表層藻類(lèi)和真菌產(chǎn)生，不利于植株生長(zhǎng)，更易招致蠅類(lèi)、蛆類(lèi)害蟲(chóng)的產(chǎn)生。

當(dāng)擬南芥植株葉片深綠色時(shí)，表明土壤肥力夠；當(dāng)植株呈現(xiàn)出輕微淡綠色時(shí)，表明營(yíng)養(yǎng)供給不足，應(yīng)立即施以1/2MS營(yíng)養(yǎng)液。本實(shí)驗(yàn)是在幼苗期、抽苔前分別追施一次1/2MS營(yíng)養(yǎng)液。

2.3.5 病蟲(chóng)害防治

培養(yǎng)室中擬南芥病蟲(chóng)害的防治是一項(xiàng)長(zhǎng)期工作，需要從實(shí)際情況出發(fā)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境條件、季節(jié)情況、擬南芥的不同生長(zhǎng)時(shí)期，采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行防治。課題組主要采用嚴(yán)格控制室內(nèi)溫度預(yù)防病蟲(chóng)害的發(fā)生，利用黃板誘殺果蠅及溫室白粉虱。培養(yǎng)基質(zhì)表面有長(zhǎng)綠色青苔現(xiàn)象，通過(guò)控制澆水量，放置風(fēng)扇增加空氣流通可以得到有效解決。總體原則是防大于治，將盡可能將病蟲(chóng)害消滅于初發(fā)狀態(tài)。

3 討 論

擬南芥生長(zhǎng)的最適溫度一般是(22±2) ℃，光照60～100 μmol/m2s左右較好。但各實(shí)驗(yàn)室條件和國(guó)內(nèi)各地的氣候條件均不相同。研究發(fā)現(xiàn)擬南芥移栽后其生長(zhǎng)周期、形態(tài)特征會(huì)受到光照、溫度等外界因素的影響[6]，因此要根據(jù)實(shí)際情況適時(shí)調(diào)整培養(yǎng)條件。東北地區(qū)冬季漫長(zhǎng)，氣溫低而干燥，不利于擬南芥的生長(zhǎng)，夜晚氣溫持續(xù)低溫時(shí)，擬南芥蓮座葉變紫；如果在夏季，室溫連續(xù)超過(guò)28 ℃以上時(shí)，擬南芥的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期縮短，抽苔早，花序矮而細(xì)弱，不利于基因的轉(zhuǎn)化工作。冬季室內(nèi)氣溫低時(shí)，可在培養(yǎng)架周?chē)芰媳∧ひ员?，通過(guò)延長(zhǎng)光照時(shí)間、增加光照強(qiáng)度等因素而縮短其生長(zhǎng)周期；夏季嚴(yán)格控制室內(nèi)溫度，可適當(dāng)縮短光照周期和光照強(qiáng)度。通過(guò)實(shí)驗(yàn)室的多年工作實(shí)踐，本文不僅為研究者提供了東北地區(qū)種植擬南芥的資料，而且對(duì)擬南芥的種植、管理細(xì)節(jié)進(jìn)行了分析。試驗(yàn)表明，在東北地區(qū)室內(nèi)低溫條件下完全可種植擬南芥，改進(jìn)的培養(yǎng)方法能較好地滿足研究者的實(shí)驗(yàn)需要。

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