不同栽培年限伊貝母組織化學研究

張鵬葛，盛 萍，2*，安露莎，盧曉麗，王延蛟，徐海燕，2

(1.新疆名醫(yī)名方與特色方劑學重點實驗室，新疆 烏魯木齊830011；2.新疆醫(yī)科大學 中醫(yī)學院，新疆 烏魯木齊 830011)

伊貝母是《中華人民共和國藥典》收載的、常用名貴大宗藥材，為百合科植物新疆貝母FritillariawalujewiiRegel 或伊犁貝母FritillariapallidifloraSchrenk的干燥鱗莖。自1977年始收載在《中華人民共和國藥典》歷次版本中。性微寒，味苦，歸肺、心經(jīng)，具有清熱潤肺，化痰止咳之功效。臨床上常用于肺熱燥咳，干咳少痰，陰虛勞咳，咳痰帶血等癥[1]。在臨床應有方面與藥材川貝母相同，是中醫(yī)處方和中成藥生產(chǎn)常用的名貴藥材。其野生品種僅分布在中國新疆境內(nèi)[2-3]，為國家三級重點保護野生藥材。由于野生伊貝母藥材資源破壞嚴重，近年伊貝母作為我區(qū)道地藥材的種植逐漸受到重視。研究表明，伊貝母主要藥用成分為生物堿類和皂苷類成分[4]。目前，有關(guān)伊貝母總生物堿含量的動態(tài)變化、HPLC分析及藥代動力學方面均有報道[5-6]，但涉及到藥材質(zhì)量和合理采收期與伊貝母藥材體內(nèi)總生物堿和總皂苷分布的組織結(jié)構(gòu)及其相互間的關(guān)系方面未見報道，為此本文應用徒手切片法對伊貝母鱗莖的組織結(jié)構(gòu)進行觀察，同時運用組織化學方法研究總生物堿和總皂苷在不同栽培年限伊貝母鱗莖中的分布及其含量差異，為指導人工栽培和確定伊貝母最佳采收期，及合理開發(fā)利用和保護伊貝母藥材資源提供科學依據(jù)。

1 儀器與材料

Mikroskop Primo Star X2005型數(shù)碼顯微鏡，供試材料為不同栽培年限伊貝母藥材，經(jīng)新疆醫(yī)科大學中醫(yī)學院盛萍教授鑒定為百合科植物新疆貝母FritillariawalujewiiRegel或伊犁貝母FritillariapallidifloraSchrenk的干燥鱗莖。憑證標本存放于新疆醫(yī)科大學中醫(yī)學院中藥資源教研室。新疆貝母FritillariawalujewiiRegel按不同栽培年限(3年、4年、5年)以W1、W2、W3表示；伊犁貝母FritillariapallidifloraSchrenk按不同栽培年限(3年、4年、5年)以P1、P2、P3表示，伊貝母藥材樣品信息見表1。

表1 不同栽培年限伊貝母藥材信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 植物解剖學方法

對實驗材料采用徒手切片方法，在Mikroskop Primo Star X2005型數(shù)碼顯微鏡下觀察并記錄藥材顯微組織結(jié)構(gòu)特征。

2.1.2 生物堿組織化學方法

對實驗材料采用徒手切片方法，并放置于載玻片上直接滴加改良碘化鉍鉀試劑[7](0.85 g堿式硝酸秘溶于10 mL冰醋酸和40 mL蒸餾水后，再與20 mL 40%的碘化鉀溶液混合而成)染色60～150 s，產(chǎn)生生物堿沉淀，在Mikroskop Primo Star X2005型數(shù)碼顯微鏡下觀察并拍照，以只加稀甘油處理的切片為對照組。對不同栽培年限伊貝母藥材中總生物堿的粗略定性量化測定：各取6張不連續(xù)的切片進行比較觀察，每張切片觀察4個視野，根據(jù)生物堿黃色沉淀顆粒的分布密度及大小，劃分為5個等級：+++++級，顆粒的分布密度密、顆粒大；++++級，顆粒的分布密度中等、顆粒大或顆粒的分布密度密、顆粒中等；+++級，顆粒的分布密度中等、顆粒中或顆粒的分布密度密、顆粒小或顆粒的分布密度稀、顆粒大；++級，顆粒的分布密度稀、顆粒中等；+級，顆粒的分布密度稀、顆粒小或無。

2.1.3 皂苷組織化學方法

對實驗材料進行徒手切片，并放置于載玻片上直接滴加等量的5%香草醛-冰醋酸和高氯酸混合試劑[8](1g香草醛溶于20 mL冰醋酸，再與等量的高氯酸混合而成)，染色2 min后，在Mikroskop Primo Star X2005型數(shù)碼顯微鏡下觀察并拍照，以只加稀甘油處理的切片為對照組。對不同栽培年限伊貝母藥材中總皂苷的粗略定性量化測定：各取6張不連續(xù)的切片進行比較觀察，每張切片觀察4個視野，根據(jù)總皂苷與皂苷顯色劑反應顏色的深淺，劃分為5個等級：+++++級，深紫色；++++級，紫紅色；+++級，紅色；++級，淡紅色；+級，顏色淺或無。

2.2 結(jié)果

2.2.1 伊貝母橫切面組織結(jié)構(gòu)特征

伊貝母兩種法定基源植物的鱗莖主要是由表皮，皮層薄壁組織，有限外韌型維管束組成，含有大量淀粉粒及少量單細胞非腺毛，單細胞非腺毛長40～210 μm。表皮細胞類長方形，排列較緊密，偶見氣孔。薄壁組織細胞類橢圓形或多角形，排列較疏松，其上分布有大量淀粉粒。淀粉粒多為單粒，為廣卵形、類球形、長圓形、橢圓形。大小差異較大，直徑為 5～40 μm，少見復粒，復粒由2～4個單粒組成，觀察結(jié)果同文獻[9]的結(jié)果相一致。維管束中導管多為螺紋導管。不同栽培年限的伊貝母維管束數(shù)目不同：3年、4年和5年生的新疆貝母的維管束數(shù)目依次為：40～42束、44～48束、52～56束，每個維管束中螺紋導管的數(shù)目逐年無明顯變化，多為3～5個；3年、4年和5年生的伊犁貝母的維管束逐年無明顯變化，多為30～33束，每個維管束中螺紋導管的數(shù)目不同，依次為：2～4個、4～6個、5～7個。

2.2.2 生物堿組織化學分布情況

對伊貝母鱗莖的徒手切片進行碘化鉍鉀沉淀反應后，可觀察到在伊貝母鱗莖的薄壁組織細胞的細胞壁和維管束周圍的薄壁組織細胞中含有較多的黃色——深黃色生物堿沉淀，表皮細胞上有較少分布(圖1)。隨著栽培年限的增加，新疆貝母鱗莖中的生物堿沉淀物逐年減少，栽培3年和4年的新疆貝母鱗莖中總生物堿含量較高(圖1：3-8)；伊犁貝母鱗莖中的生物堿沉淀也隨著栽培年限的增加，而逐年減少，栽培3年和4年的伊犁貝母鱗莖中總生物堿含量較高(圖1：9-14)。對伊貝母鱗莖的生物堿沉淀反應進行量化表明，伊貝母鱗莖中生物堿沉淀在不同顯微組織結(jié)構(gòu)部位、不同栽培年限、不同種間存在量上的變化(表2)。

圖1 不同栽培年限伊貝母總生物堿組織化學定位

2.2.3 皂苷組織化學分布情況

對伊貝母鱗莖的徒手切片進行5%香草醛-冰醋酸和高氯酸混合試劑處理后，可觀察到在伊貝母鱗莖的表皮細胞和維管束周圍的薄壁組織細胞中按皂苷含量由少至多，呈現(xiàn)出淡紅—紅—紫紅—深紫的顏色變化，而薄壁組織細胞內(nèi)皂苷含量缺乏(圖2)。隨著栽培年限的增加，新疆貝母鱗莖中的皂苷反應顏色逐年變深，栽培5年和4年的新疆貝母鱗莖中總皂苷含量較高(圖2：3-8)；伊犁貝母鱗莖中的皂苷反應顏色也隨著栽培年限的增加，而逐年變深，栽培5年和4年的伊犁貝母鱗莖中總皂苷含量較高(圖2：9-14)。對伊貝母鱗莖的皂苷反應顏色進行量化表明，伊貝母鱗莖中皂苷在不同顯微組織結(jié)構(gòu)部位、不同栽培年限、不同種間存在量上的變化(表2)。

表2 不同栽培年限伊貝母組織結(jié)構(gòu)中生物堿和皂苷的分布及其含量的比較

圖2 不同栽培年限伊貝母總皂苷組織化學定位

續(xù)表2

3 討 論

3.1 伊貝母橫切面組織結(jié)構(gòu)特征

新疆貝母和伊犁貝母鱗莖的顯微組織結(jié)構(gòu)基本相同，新疆貝母的維管束數(shù)目略大于伊犁貝母，新疆貝母隨著栽培年限的增加其維管束的個數(shù)也逐年增長，但維管束中的導管數(shù)沒有明顯增長；伊犁貝母隨著栽培年限的增加其維管束的個數(shù)沒有明顯增長，但維管束中的導管數(shù)卻有相應的增長。隨著栽培年限的增長，新疆貝母和伊犁貝母鱗莖中總的導管數(shù)逐年增長，從而可以把根部吸收的水和無機鹽輸送到植株身體各處，以滿足伊貝母隨著栽培年限的增長所需要營養(yǎng)物質(zhì)的增加量。

3.2 伊貝母中生物堿分布特點

在文獻[10]中，對生物堿顯色劑進行了比較和確立，發(fā)現(xiàn)碘化鉍鉀試劑處理觀察生物堿較為理想，因此本實驗中直接采用碘化鉍鉀試劑作為生物堿顯色劑，生物堿同碘化鉍鉀試劑能生成黃色到深黃色的不定型沉淀(低倍鏡下呈小黑點)。伊貝母鱗莖中的生物堿主要分布于薄壁組織細胞的細胞壁及維管束周圍薄壁組織細胞中，而表皮細胞上有較少分布，研究結(jié)果同文獻[10]報道相一致。因此，在選擇栽培品種及年限時，選擇薄壁組織和維管束周圍薄壁組織占鱗莖橫切面百分比大的藥材，并且在栽培時，可以采取一些增加生物堿含量的栽培措施，從而提高藥材質(zhì)量。從表2可知，不同栽培年限伊貝母藥材中生物堿含量由高到低的順序為：3年生的伊貝母≥4年生的伊貝母?5年生的伊貝母，結(jié)果同文獻[11]中一致。相同栽培年限的新疆貝母總生物堿含量略低于伊犁貝母，這可能與伊犁貝母比新疆貝母形狀大有一定關(guān)系，以生物堿含量為選擇栽培年限作為指標，可推斷3年生和4年生為伊貝母最佳栽培年限。

3.3 伊貝母中皂苷分布特點

對伊貝母鱗莖總皂苷的組織化學定位研究表明：伊貝母藥材中總皂苷與皂苷顯色劑發(fā)生反應，呈現(xiàn)出淡紅—紅—紫紅—深紫的顏色變化。表皮細胞和維管束周圍薄壁組織細胞中皂苷含量比薄壁組織細胞中皂苷含量多，從表2可知，不同栽培年限伊貝母藥材中皂苷含量由高到低的順序為：5年生的伊貝母≥4年生的伊貝母>3年生的伊貝母，而相同栽培年限的新疆貝母總皂苷含量明顯高于伊犁貝母。以皂苷含量為選擇栽培年限作為指標，可推斷4年和5年生為伊貝母最佳栽培年限。

根據(jù)伊貝母不同栽培年限中總生物堿和總皂苷含量動態(tài)變化分析，伊貝母中總生物堿和總皂苷有效成分含量均較高時，推斷第4年應為最佳采收期。值得提出的是我們觀察生物堿和皂苷分布的研究結(jié)果與課題組進行的不同栽培年限伊貝母總生物堿含量測定的研究結(jié)果完全吻合。

在文獻[12]中研究表示貝母中生物堿同淀粉粒有一定關(guān)系，而在本實驗中，不同栽培年限伊貝母總生物堿和總皂苷含量的動態(tài)變化中，可觀察到：在不同組織結(jié)構(gòu)、栽培年限、種間中隨著總生物堿含量增加而總皂苷含量相應減小。因此，皂苷、生物堿、淀粉粒這三者的關(guān)系在伊貝母中還有待進一步的研究。

參考文獻：

[1] 國家藥典委員會.中國藥典.一部[S].北京：化學工業(yè)出版社,2010: 132.

[2] 中國植物志編輯委員會.中國植物志：第14卷[M].北京: 科學出版社,1980: 102.

[3] 新疆生物土壤沙漠研究所.新疆藥用植物志[M].烏魯木齊: 新疆人民出版社,1977: 186-199.

[4] 李 萍,季 暉,徐國鈞,等.貝母類中藥的鎮(zhèn)咳祛痰作用研究[J].中國藥科大學學報,1993,24(6): 360-362.

[5] 董文杰,軒轅歡,陳良.伊貝母不同物候期的總生物堿類化合物含量動態(tài)變化研究[J].新疆中醫(yī)藥,2012,30(6): 37-39.

[6] 曾令杰,林鴿,李萍.伊貝母生物堿的HPLC分析及藥代動力學研究[J].中藥新藥與臨床藥理,2003,14(1): 37-38.

[7] 呂洪飛,羅文姬,盛仙永,等.兩種石斛屬植物和小葉石仙桃生物堿的組織化學定位[J].中國藥學雜志,2006,41(11): 824-827.

[8] 譚玲玲,蔡霞,胡正海.柴胡和狹葉柴胡營養(yǎng)器官結(jié)構(gòu)及其化學成分比較研究[J].中草藥,2010,41(8): 1380-1383.

[9] 黃小鷗,莫可豐,何報作,等.5種貝母類藥材的定性鑒別[J].中國藥房,2009,20(21): 1655-1656.

[10] 楊楊,姜虹,傅華龍,等.野生和組培川貝母總生物堿含量的測定和定位研究[J].四川大學學報,2008,45(1): 209-213.

[11] 何心亮.伊貝母生物堿含量與種植年限的關(guān)系[J].中藥材,1988,11(4): 14-16.

[12] 蔡朝暉,李萍,李會軍,等.蒲圻貝母組織培養(yǎng)鱗莖形成過程中生理生化變化研究[J].武漢植物學研究,1999,17(4): 314-318.