超聲波提取-樹脂純化多穗柯葉中甜味劑的工藝研究

李愛民，李勝華，張 元，劉 英，李 斌，伍賢進*

(1.懷化學(xué)院 民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室,湖南 懷化418008;2.懷化學(xué)院 湘西藥用植物與民族植物學(xué)湖南省高校重點實驗室 生命科學(xué)系，湖南 懷化418008)

多穗柯[Lithocarpuslitseifolius(Hance) Chun]為殼斗科(Fagaceae)柯屬常綠植物[1]，因其葉浸泡后具有很高的甜味，而被稱為甜茶。多穗柯多以野生狀態(tài)分布于長江以南各省區(qū)，其中湖南、福建、江西、廣西、安徽等省資源豐富且集中，湖南以雪峰山一帶分布較多。據(jù)《全國中草藥匯編》等記載：多穗柯茶能防治高血壓、治療濕熱痢疾、皮膚瘙癢、癰疽惡瘡等癥，而且具有滋養(yǎng)肝腎、和胃降逆、潤肺止咳、解困醒酒等功效[2-3]。另外，甜茶在抗炎、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫、增強抗應(yīng)激能力、改善微循環(huán)、抗心肌缺血、降血脂、抗脂肪肝、抗Ⅱ型糖尿病及糖尿病并發(fā)癥、協(xié)同增進抗腫瘤藥物療效等藥理方面也有作用[4-7]。研究發(fā)現(xiàn)多穗柯葉所含的甜味劑，主要成分是根皮苷和二氫查耳酮[8-10]，甜度為蔗糖的300倍，而且其毒性較低，安全范圍較廣，與蔗糖混用效果更好[11]。因此，研究多穗柯中所含甜味劑的提取分離及純化技術(shù)，具有重要的理論及實踐意義。

大孔樹脂分離技術(shù)是近年來發(fā)展起來的新型分離純化技術(shù)，具有物理穩(wěn)定性高、吸附選擇性好、再生簡便、解吸條件溫和、使用周期長等優(yōu)點，而廣泛應(yīng)用于植物天然產(chǎn)物的分離純化。利用大孔樹脂分離黃酮類物質(zhì)已有不少報道[12-15]。多穗柯作為一種天然的糖類植物，其甜味劑的研究還比較少，目前多是對多穗柯中總黃酮[16]或單一成分[17-19]進行純化、測定，不利于多穗柯甜茶及其他產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定。本文利用超聲波提取法和大孔樹脂純化法對多穗柯葉中甜味劑的主要成分根皮甙和新橙皮苷二氫查爾酮的提取及純化工藝進行了系統(tǒng)研究，旨在獲得提取及純化多穗柯葉中甜味劑的最佳工藝，為規(guī)?；枚嗨肟氯~的甜味劑及其質(zhì)量評價提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

多穗柯葉采集于湖南芷江縣，經(jīng)伍賢進教授鑒定為殼斗科植物多穗柯[Lithocarpuslitseifolius(Hance) Chun]的葉。

1.2 試劑與儀器

AB-8型大孔樹脂(天津海光化工有限公司)；根皮苷和新橙皮苷二氫查爾酮(NHDC)對照品(>99%) (Sigma公司)；色譜甲醇(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；純凈水(懷化娃哈哈恒楓飲料有限公司)；乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉等均為分析純。

CTXNW-10B超聲波循環(huán)提取儀(北京弘祥隆生物技術(shù)開發(fā)有限公司)；RE-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；LC-20A高效液相色譜儀(日本島津生物儀器有限公司)；AL104電子天平(美國Mettler-Toledo儀器公司)；CTXNW-10B超聲波循環(huán)提取儀(北京弘祥隆儀器有限公司)；OSB-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；202-3A型電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；KQ2200DA型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；中草藥粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 多穗柯甜味劑的提取

準(zhǔn)確稱取多穗柯粉末2.00 g，按固液比例加入乙醇溶液，對其進行超聲波輔助提取，乙醇浸泡24 h后，抽濾，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后用色譜甲醇洗脫至100 mL容量瓶，定溶得待測樣品液備用。

1.3.2 甜味劑含量測定

1.3.2.1 色譜條件

色譜柱：WondasilTMC18柱；流動相：A泵為1% mol/L的NaH2PO4溶液，B泵為甲醇；流速：1 mL/min；檢測波長：283 nm；進樣體積：20 μL。

1.3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取在80 ℃下干燥至恒重的根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg，新橙皮苷二氫查爾酮(NHDC)標(biāo)準(zhǔn)品5.00 mg，混合后用色譜甲醇溶解，定容至25 mL，即得0.40 mg/mL根皮苷與0.20 mg/mL NHDC的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL于5支25 mL定量管中，用色譜甲醇定容至刻度線，混勻放置15 min。HPLC在283 nm處測定各定量管中溶液的峰面積。重復(fù)3組，取平均值。以根皮苷濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)得標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=2 510 027 445.00x+23 157.51，R=0.999 9；以NHDC濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)得標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=5 850 158 256.25x+9 414.97，R=0.999 9。二者在0.002～0.008 mg/mL的范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系。

1.3.2.3 樣品中甜味劑含量的測定

取經(jīng)1.2.1步驟制得的樣品液10 mL置于10 mL定量管中過濾，精密量取濾液20 μL進樣，按標(biāo)準(zhǔn)品同樣的色譜條件測定，記錄40 min樣品圖，計算甜味劑的含量和得率。

甜味劑得率(%)= 樣品中甜味劑含量×樣品溶液體積/樣品干重×100%。

1.3.3 超聲波提取單因素實驗

1.3.3.1 乙醇濃度的選擇

分別用50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液50 mL浸泡2.0 g的樣品，在600 W功率下超聲波提取45 min，按1.2.2方法測定HPLC波峰面積，計算根皮苷和NHDC含量。

1.3.3.2 固液比的選擇

用70%的乙醇，使固液比分別為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35，在600 W功率下超聲波提取45 min，按1.2.2方法測定HPLC波峰面積，計算根皮苷和NHDC含量。

1.3.3.3 超聲波萃取時間的選擇

在固液比1∶25，70%乙醇條件下選擇時間分別為25 min、35 min、45 min、55 min、65 min進行超聲波提取(600 W)，按1.2.2方法測定HPLC波峰面積，計算根皮苷和NHDC含量。

1.3.4 大孔樹脂純化甜味劑

1.3.4.1 大孔樹脂的處理

將AB-8型大孔樹脂使用前用2倍體積的5%的氫氧化鈉水溶液浸泡12 h，再用水沖洗至排除液為中性。然后用1 mol/L鹽酸浸泡12 h，之后用水沖洗去至中性。再用無水乙醇浸泡12 h，再用水洗至中性。最后用蒸餾水水養(yǎng)。

1.3.4.2 吸附與解析單因素實驗

(1)乙醇濃度對解析的影響。對5份相同的樣品液在相同流速和相同的吸附柱上進行吸附，分別在50%、60%、70%、80%、90%乙醇的條件下進行洗脫，洗脫完后，減壓濃縮回收乙醇，色譜甲醇定容，用高效液相色譜法測定根皮苷和NHDC的含量。

(2)洗脫液體積對解析的影響。對5份相同的樣品液，相同條件下，分別在0.625 BV、1.25 BV、1.875 BV、2.5 BV、3.125 BV的條件下進行洗脫，收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸干，色譜甲醇定容，用高效液相色譜法測定根皮苷和NHDC的含量。

(3)洗脫流速對解析的影響。對5份相同的樣品液，相同條件下，分別在1 mL/min、1.5 mL/min、2 mL/min、2.5 mL/min、3 mL/min的條件下進行洗脫，收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸干，色譜甲醇定容，用高效液相色譜法測定根皮苷和NHDC的含量。

(4)吸附流速對吸附的影響。對5份相同的樣品液，在相同流速和相同的吸附柱上進行吸附，分別在1 mL/min、1.5 mL/min、2 mL/min、2.5 mL/min、3 mL/min的條件下進行吸附實驗，用高效液相色譜法測定其洗脫液中根皮苷和NHDC的含量。

1.3.5 正交試驗優(yōu)化純化條件

以多穗柯中根皮苷和NHDC的純度作為考察指標(biāo)，對乙醇濃度、洗脫劑體積、洗脫劑流速、吸附流速4個因素進行優(yōu)選。每個因素設(shè)3個水平，采用L9(34)正交設(shè)計，考察因素設(shè)計見表1。

表1 正交實驗因素表

1.3.6 甜味劑純度計算

洗脫液旋轉(zhuǎn)濃縮后冷凍干燥至恒重得甜味劑精制品，準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量(m1)mg樣品，用適量甲醇溶解定容后，按1.2.2方法分別測定根皮苷和NHDC含量(m2)mg，計算樣品純度：

純度(%)=m2/m1×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC圖譜的建立

按照1.2.2色譜條件分別建立對照品的HPLC圖和樣品HPLC色譜圖，圖譜見下圖(圖1和圖2)，從圖可以看出，樣品在此條件下分離效果較好。

圖1 根皮苷和NHDC混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖2 多穗柯樣品溶液HPLC圖

2.2 單因素實驗結(jié)果及分析

2.2.1 乙醇濃度對根皮苷、新橙皮苷二氫查爾酮提取的影響

圖3表明：當(dāng)乙醇濃度的增加時，根皮苷和新橙皮苷二氫查爾酮的提取率也逐漸增加，但是當(dāng)乙醇濃度超過70%的時候，根皮苷和新橙皮苷二氫查爾酮的提取率隨乙醇濃度增加反而略有降低，原因可能是乙醇濃度的增大，使樣品中粗提雜質(zhì)含量增加，因而有效成分相對含量降低，從而影響提取物有效含量。

圖3 乙醇濃度對提取根皮苷和新橙皮苷二氫查爾酮的影響

2.2.2 固液比對多穗柯根皮苷、新橙皮苷二氫查爾酮提取的影響

浸提固液比在1∶15至1∶25的范圍內(nèi)，根皮苷和新橙皮苷二氫查爾酮的提取率是隨著固液比的增加而不斷上升的，且浸提固液比在1∶25時提取率最高，但隨后增加溶劑的量增加而提取率基本變化不大。而在實際操作中，當(dāng)浸提固液比過大時，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)轉(zhuǎn)移溶劑時耗時長耗能多，因此選擇浸提固液比在1∶25較為合適。

圖4 固液比對提取根皮苷和新橙皮苷二氫查爾酮的影響

2.2.3 超聲波提取時間對根皮苷、新橙皮苷二氫查爾酮提取的影響

隨超聲波提取時間從25 min到65 min，根皮苷和新橙皮苷二氫查爾酮的提取率是不斷升高的，但提取時間從35 min后有所下降。超聲波提取時間再增加，提取得率將呈現(xiàn)平穩(wěn)甚至略有下降的趨勢。造成這種情況的原因可能是在長時間超聲作用下，提取率逐漸向極限值靠近，致使提取得率增幅降低。同時超聲作用時間太長，會使提取粗品中雜質(zhì)含量增加，有效成分含量反而降低，影響提取物有效含量。

圖5 超聲波提取時間對提取根皮苷和新橙皮苷二氫查爾酮的影響

2.3 吸附與解析單因素實驗

2.3.1 不同濃度乙醇對洗脫效果的影響

在其他條件不變的情況下，用不同濃度的乙醇進行洗脫，結(jié)果見圖6。由圖6可知，隨著乙醇濃度的增高，洗脫液中根皮苷和新橙皮苷二氫查爾酮純度隨著乙醇濃度的增高而增高，當(dāng)乙醇濃度超過80%之后，洗脫液中根皮苷和新橙皮苷二氫查爾酮純度隨著乙醇濃度的增高而降低。究其原因，可能是一些醇溶性物質(zhì)溶出量增加，導(dǎo)致根皮苷和新橙皮苷二氫查爾酮純度降低。因此，最佳乙醇濃度確定為80%左右。

圖6 乙醇濃度對純化根皮苷和新橙皮苷二氫查爾酮的影響

2.3.2 洗脫液不同體積對純化效果的影響

其他條件不變，改變洗脫液體積，所得根皮苷和新橙皮苷二氫查爾酮純度結(jié)果見圖7。由圖7可知，隨著洗脫液體積的增加，根皮苷和新橙皮苷二氫查爾酮的純度逐漸增高，達到最高峰后緩慢下降。這是因為用洗脫液體積太小，吸附在樹脂上的根皮苷和新橙皮苷二氫查爾酮不能完全被洗脫下，從而使得洗脫液中含量較低。在1.25 BV時，根皮苷和二氫查耳酮純度達到最大。因此，最佳的乙醇洗脫體積確定為1.25 BV左右。

圖7 洗脫液體積對純化根皮苷和新橙皮苷二氫查爾酮的影響

2.3.3 洗脫液不同流速對純化效果的影響

其他條件不變，改變洗脫液流速，結(jié)果見圖8。由圖8可知，隨著洗脫液流速的增加，洗脫液中根皮苷和新橙皮苷二氫查爾酮純度逐漸下降。這是由于洗脫液流速增大時，與樹脂的接觸時間相對要減小，從而使樹脂上的根皮苷和新橙皮苷二氫查爾酮不能很好的被洗脫下來。當(dāng)洗脫流速在1 mL/min時，根皮苷和新橙皮苷二氫查爾酮純度相對最大，當(dāng)洗脫流速在3 mL/min時，純度相對最小。因此，本實驗乙醇洗脫流速確定為1 mL/min左右。

2.3.4 吸附流速對吸附的影響

其他條件不變，改變吸附流速，結(jié)果見圖9。從圖9可以看出，隨著吸附流速的增高，洗脫液中根皮苷和新橙皮苷二氫查爾酮的純度越高，意味著二者被吸附的量越少。當(dāng)吸附流速為1 mL/min時，在洗脫液中根皮苷和新橙皮苷二氫查爾酮含量最小，被樹脂吸附的量最多，吸附效果最好。因此，最佳洗脫液流速應(yīng)不超過1 mL/min。

圖8 洗脫劑流速對純化根皮苷和新橙皮苷二氫查爾酮的影響

圖9 吸附流速對純化根皮苷和新橙皮苷二氫查爾酮的影響

2.3.5 正交實驗設(shè)計結(jié)果

以多穗柯中根皮苷和新橙皮苷二氫查爾酮的純度作為考察指標(biāo)，實驗結(jié)果及方差分析見表2和表3。

表2 正交實驗結(jié)果

續(xù)表2

表3 正交實驗結(jié)果的方差分析

通過綜合比較各因素的極差值(R)可以看出，乙醇濃度(A)、洗脫劑體積(B)、洗脫劑流速(C)、吸附速度(D)這4個因素對純化根皮苷和新橙皮苷二氫查爾酮的影響是不同的。對于純化根皮苷來說，影響因素大小順序為B>A>C>D，最佳組合為A3B3C3D3；對于純化新橙皮苷二氫查爾酮來說，影響因素大小順序為B>A>D>C，最佳組合為A3B3C3D3。由方差分析可知，乙醇濃度(A)、洗脫劑體積(B)、洗脫劑流速(C)、吸附速度(D)這4個因素對純化根皮苷和新橙皮苷二氫查爾酮的影響均沒有顯著性差異。由于乙醇濃度(A)、洗脫劑體積(B)對純化效果的影響要大于洗脫劑流速(C)、吸附速度(D)對純化效果的影響，考慮單因素實驗的結(jié)果，對洗脫劑流速(C)、吸附速度(D)進行了調(diào)整，得到純化這兩種物質(zhì)的最佳組合為A3B3C2D1，即最佳工藝條件為：乙醇濃度：90%、洗脫液體積：1.875 BV、洗脫劑流速：1 mL/min、吸附流速：0.5 mL/min。按照最佳條件進行3次重復(fù)實驗，結(jié)果根皮苷的平均純度為88.616%，新橙皮苷二氫查爾酮的平均純度為71.8226%。與正交試驗最大值接近，說明方法可行。

3 結(jié)論與討論

采用HPLC檢測分析根皮苷和新橙皮苷二氫查爾酮純度，獲得了超聲波提取、AB-8樹脂純化多穗柯葉中甜味劑的最佳工藝條件。該方法簡單易行，快速高效，精確度高，設(shè)備簡單，為多穗柯甜味劑的工業(yè)化提取提供了依據(jù)。曾有報道[20]比較了水提法和乙醇回流法從多穗柯葉中提取總黃酮類化合物的最佳條件，認為用25倍量80%乙醇回流2 h，能得到總黃酮類物質(zhì)含量為12.59%。李勝華等[16]用超聲波輔助提取多穗柯葉中的總黃酮，以原料35倍量的70% 乙醇作為溶劑，在提取功率600 W、提取時間15 min 的條件下，即可獲得多穗柯總黃酮最佳提取效果，提取時間大大縮短。我們用超聲波提取根皮苷和新橙皮苷二氫查爾酮，提取時間也僅需35 min，相對于于麗靜等[21]80 ℃水浸提60 min來提取二氫查耳酮的工藝，也要節(jié)省時間?？梢姴捎贸暡ㄝo助提取比傳統(tǒng)的提取工藝省時，與微波提取時間幾乎相當(dāng)[22]。超聲波提取不同的植物有效成分結(jié)果不同，即使是提取同一植物有效成分，也會因參數(shù)的變化而得到不同的實驗結(jié)果。本方法乙醇為溶劑，超聲波提取，提取工藝非常簡單，條件容易控制，提取率高。乙醇易除凈，對人體基本無毒害作用，因此項目具有很好的開發(fā)前景。

本實驗通過單因素實驗和L9(34)正交實驗設(shè)計得出根皮苷和新橙皮苷二氫查爾酮的最佳分離純化工藝為：乙醇濃度：90%、洗脫劑體積：1.875 BV、洗脫劑流速：1 mL/min、吸附流速：0.5 mL/min。通過3次驗證實驗，根皮苷的平均純度為88.616%，新橙皮苷二氫查爾酮的平均純度為71.823%。通過方差分析表明洗脫劑體積對工藝的影響較其他顯著。由于根皮苷和二氫查耳酮是兩種不同的物質(zhì)，所以不同的條件對其分離純化效果的影響不同。

在本實驗中，選擇乙醇作為洗脫劑，不僅較其他有機溶劑經(jīng)濟，而且乙醇毒性小，安全，對黃酮類物質(zhì)有較好的溶解效果，易揮發(fā)，縮短了后續(xù)黃酮類物質(zhì)干燥的所需的時間，從而縮短了整個工藝流程的時間。

根皮苷和新橙皮苷二氫查爾酮是多穗柯甜味劑中的兩種重要的物質(zhì)，大孔樹脂同時分離純化多穗柯中的根皮苷和新橙皮苷二氫查爾酮，提高了其效率，分離純化效果較好，為多穗柯甜味劑的開發(fā)利用提供了一定的依據(jù)。

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