高效液相色譜檢測血漿伏立康唑濃度研究

雷 玲

(海軍總醫(yī)院藥劑科，北京 100048)

伏立康唑作為一種新型高效廣譜抗菌藥物，在臨床抗真菌治療方面發(fā)揮著重要作用。伏立康唑于2002年經(jīng)美國食品藥品管理局批準(zhǔn)上市[1]，其抗菌機(jī)制主要是抑制麥角甾醇生成，引起真菌細(xì)胞膜的完整性遭到破環(huán)，導(dǎo)致真菌細(xì)胞死亡[2-3]。伏立康唑還具有間接的免疫調(diào)節(jié)功能[4]。該藥抗菌譜主要包括急性侵襲性曲霉菌、侵襲性念珠菌屬、足放線病菌屬和鐮刀菌屬等[5-6]。值得注意的是，該藥的個體代謝差異較大[7-9]，因此在臨床上應(yīng)對伏立康唑的血漿藥物濃度進(jìn)行檢測，實(shí)現(xiàn)個體化治療具有重要的意義。高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測器進(jìn)行檢測，從而實(shí)現(xiàn)對試樣的分析。本試驗(yàn)利用HPLC對患者血漿中伏立康唑濃度進(jìn)行分析，旨在為臨床用藥提供依據(jù)、提高其臨床藥效。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2013年1月至2013年12月在海軍總醫(yī)院感染科室中采用伏立康唑治療真菌感染的患者60例，根據(jù)患者意愿及治療方案將患者分為口服組40例，注射組20例。口服組中男22例、女18例，年齡18～58(32.6±2.9)歲。注射組中男10例、女10例，年齡18～60(33.5±3.2)歲。所有患者在試驗(yàn)前1個月均未服用任何藥物，均于試驗(yàn)前詢問病史，進(jìn)行心電圖、血尿常規(guī)等檢查，合格者納入試驗(yàn)對象，并簽署知情同意書。

1.2HPLC法檢測伏立康唑濃度

1.2.1儀器與試劑 Agilent1100型高效液相色譜儀(包括Agilent色譜工作站，四元輸液泵，G1316A柱溫箱，自動進(jìn)樣器，二極管陳列檢測器)(美國安捷倫公司生產(chǎn))，AB204-A型電子分析天平[梅特勒-托利多(上海)儀器公司生產(chǎn)]，旋渦混合儀(北京踏錦科技有限公司生產(chǎn)，Muti-Tube Vortexer VX-Ⅲ)，TG16-W型離心機(jī)(中國湘儀賽特離心機(jī)儀器有限公司生產(chǎn))。伏立康唑?qū)φ掌?批號：100862-200701)和勞拉西泮對照品(批號:030062)均購自中國藥品生物制品檢定所，純度均為100%，其中勞拉西泮對照品作為內(nèi)標(biāo)化合物。磷酸二氫鈉為分析純；甲醇、乙腈為色譜純；水為超純化水。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 勞拉西泮對照品溶液：精密稱取勞拉西泮對照品50 mg，置于50 mL容量瓶中，用50%甲醇溶液溶解并稀釋至50 mL，制成1000 mg/L的勞拉西泮對照品內(nèi)標(biāo)液，將內(nèi)標(biāo)液用甲醇稀釋為20 mg/L的工作液，置于4 ℃冰箱冷藏備用。伏立康唑?qū)φ掌啡芤?精密稱取100 mg伏立康唑?qū)φ掌?，置?00 mL容量瓶中，用50%甲醇溶液溶解并稀釋至100 mL，制成1000 mg/L的伏立康唑?qū)φ掌穬湟?，置? ℃冰箱冷藏備用。

1.3給藥方法 口服組均口服伏立康唑(成都華神集團(tuán)股份有限公司制藥廠，批號:20060223)，每日給藥2次，每次4mg/kg，持續(xù)用藥2周。靜脈注射組以4 mg/kg伏立康唑(麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠，批號：20070504)+5%葡萄糖200 mL靜脈注射，每日2次，持續(xù)用藥7 d。

1.4HPLC法進(jìn)行濃度測定

1.4.1色譜條件 色譜柱為ZORBAX Extend-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流動相：0.1 mol/L磷酸二氫鈉-水-乙腈(20 ∶35 ∶45)，流速為：1.0 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量20.0 μL，檢測波長為256 nm。

1.4.2血樣采集 所有受試者試驗(yàn)前10 h進(jìn)食清淡食物，禁食過夜，于次日清晨給藥，給藥后2 h方可飲水，4 h后統(tǒng)一進(jìn)食低脂食物。采用肘靜脈取血的方法分別在給藥前(0 h)和給藥后0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，4.0，6.0，8.0，12.0，24.0 h取血5.0 mL，注入肝素抗凝管中，以離心半徑20 cm，3000 r/min離心10 min，取上層血漿置于-65 ℃保存待測。

1.4.3血漿樣品處理與測定 精密量取200 μL的血漿樣品置于2 mL的離心管中，加入勞拉西泮內(nèi)標(biāo)液100 μL，混合均勻，加入100 μL的氫氧化鈉溶液(0.1 mg/L)以堿化血漿，用乙酸乙酯-二氯甲烷(75∶25)1.5 mL進(jìn)行萃取，旋渦振蕩5 min，3500 r/min離心10 min，取上清液置于另一個2 mL離心管中真空揮干，用100 μL流動相復(fù)溶，進(jìn)樣20.0 μL。

1.4.4標(biāo)準(zhǔn)曲線與方法專屬性 取標(biāo)準(zhǔn)空白血漿(上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司提供)1.0 mL，加入不同體積的伏立康唑?qū)φ掌穬湟?，配制濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0和10.0 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，根據(jù)HPLC測定的結(jié)果，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再分別配制伏立康唑的濃度分別為0.2、2.0和8.0 mg/L的低、中、高3種濃度血漿樣品各5份，測定日內(nèi)精密度：1 d內(nèi)低、中、高每種濃度連續(xù)測定5次；日間精密度為3 d內(nèi)，每日各濃度測定1次；穩(wěn)定性試驗(yàn)：在1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 h對血漿樣品進(jìn)行HPLC檢測，觀察不同時間色譜行為的差異程度，不同時間點(diǎn)測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)均<15%時，認(rèn)為穩(wěn)定性良好。并計算提取回收率和方法回收率，提取回收率=伏立康唑峰面積/等量伏立康唑?qū)φ掌啡芤悍迕娣e，方法回收率=實(shí)測濃度/理論濃度。

1.4.5血液樣品的測定 將所有患者經(jīng)肘靜脈采血處理后的樣品，按“1.4.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行HPLC測定，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各時間點(diǎn)血漿中伏立康唑的濃度。藥師將上述測定結(jié)果及時反饋給主管醫(yī)師，根據(jù)血藥濃度值及時調(diào)整給藥劑量和給藥方案。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均輸入Excel數(shù)據(jù)軟件中進(jìn)行分析處理，并以伏立康唑峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值Y與血藥濃度X進(jìn)行線性回歸。

2 結(jié) 果

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果 采用Excel數(shù)據(jù)軟件，得出伏立康唑濃度的線性回歸方程:Y=0.5238X+0.002(r2=0.9997)，線性范圍為0.1～10.0 mg/L。40例口服組定量下限為0.1 mg/L；20例靜脈注射組定量下限為0.12 mg/L。

2.2方法專屬性結(jié)果 HPLC檢測發(fā)現(xiàn)伏立康唑色譜峰分離良好、峰形對稱，血漿內(nèi)源性雜質(zhì)峰不明顯，口服組保留時間為5.8～8.2 min，平均保留時間為(7.0±0.9)min；靜脈注射組保留時間為6.2～8.7 min，平均保留時間為(7.4±0.9)min。勞拉西泮保留時間為5.2～6.3 min，平均保留時間為(5.68±0.36)min。所取3個濃度的血漿樣品，進(jìn)行方法學(xué)考察發(fā)現(xiàn)，日內(nèi)和日間精密度RSD均<5%，表明方法的精密度良好；回收率試驗(yàn)結(jié)果顯示，方法回收率和提取回收率較好，各濃度下均在80%～120%的范圍內(nèi)(表1)。

圖1 口服組伏立康唑面積與與內(nèi)標(biāo)峰面積的線性關(guān)系

圖2 注射組伏立康唑濃度與內(nèi)標(biāo)峰面積的線性關(guān)系

表1 伏立康唑回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=5)

2.3臨床應(yīng)用結(jié)果 40例口服組患者血漿中伏立康唑濃度為1.30～1.82 mg/L，平均濃度為(1.56±0.85)mg/L；20例靜脈注射組患者血漿中伏立康唑濃度為1.37～1.87 mg/L，平均濃度為(1.62±0.58)mg/L。

3 討 論

目前，可以采用多種方法檢測生物樣本中伏立康唑的濃度，其中主要有高效液相熒光檢測法和紫外檢測法以及高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用法[9-12]。本試驗(yàn)采用的HPLC方法檢測血漿中伏立康唑的濃度，操作具有方法專屬性高、簡單實(shí)用、靈敏度高、分離效果較好的優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)采用0.1 mol/L磷酸二氫鈉-水-乙腈(20 ∶35 ∶45)為流動相，所得峰形對稱，伏立康唑色譜峰分離完全，雜峰干擾較??；此外，采用乙酸乙酯-二氯甲烷(75 ∶25)作為萃取劑，不僅所用萃取劑減少，而且分離效果更佳，縮短了樣品處理時間。本試驗(yàn)建立的HPLC檢測方法準(zhǔn)確度好，提取回收率高，日內(nèi)和日間RSD均符合要求，達(dá)到了伏立康唑治療藥物濃度檢測要求，為臨床用藥劑量和給藥方案調(diào)整提供重要參考依據(jù)，有利于實(shí)現(xiàn)患者個體化治療的安全實(shí)施。

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