山藥食用部分石蠟切片的制作方法和鑒定研究

王耀文,王仕玉,龍雯虹

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院，云南 昆明 650201)

山藥(Dioscoreaopposita)又名土薯、山薯等，薯蕷科(Dioscoreaceae)薯蕷屬(Dioscorea)，一年生或多年生纏繞性藤本植物，是一種食用和藥用利用價值很高的作物。湖北、江蘇、河南、云南和貴州等地均有栽培。對山藥食用部分人們一般定義為塊莖或根狀莖，許多書刊均有這樣的描述[1,2]，也有一些書刊里將其稱為塊根[3,4]。根和莖的外觀區(qū)分主要看其有沒有節(jié)間，中間有節(jié)的為莖，如藕；無節(jié)的為根，如蘿卜。本試驗研究的云南當(dāng)?shù)仄贩N牛尾山藥(D.opposita)食用部分外觀似根，沒有節(jié)間。為了證實山藥食用部分是莖還是根，需要對其內(nèi)部構(gòu)造進行觀察分析，因此，找到適合于山藥地下食用部分石蠟切片的制作方法，制作出完整清晰的石蠟切片是觀察的關(guān)鍵。

常規(guī)石蠟切片制作過程主要有：取材、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、粘片、脫蠟、復(fù)水、染色、脫水、透明、封片。每一個環(huán)節(jié)都是相互關(guān)聯(lián)的，任何一個環(huán)節(jié)不到位都會影響最終制片的質(zhì)量[5]。因所取的材料不同，材料中水分、蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪等成分和含量不同，每個步驟所需的時間也不相同。制作石蠟切片能否成功最關(guān)鍵的步驟是脫水、透明和浸蠟，若植物組織中水未脫盡，殘留的水分和二甲苯、石蠟不相溶，會使浸蠟和切片失敗[6]；透明不徹底則會導(dǎo)致材料不通透以及石蠟不能借助二甲苯進入材料中；浸蠟不充分則石蠟不能完全代替透明劑進入材料組織中，切出的切片會有空洞。無論脫水過度、透明過度還是浸蠟過度，都會引起組織變硬變脆。因此，對山藥地下食用部分進行脫水、透明、浸蠟等主要影響因素進行試驗，以期找到適合山藥地下食用部分的脫水、透明、浸蠟時間，制作出較好的切片。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

云南省祿豐縣牛尾山藥(D.opposita)幼嫩地下食用部分。

1.2 取材與固定

FAA固定液的配制：70%酒精90 mL+冰醋酸5 mL+福爾馬林5 mL[7]。

挑選整齊、硬實、無病害的山藥幼嫩地下部分(直徑約0.5 cm)，洗凈擦干，切成長約1 cm的莖段，放入有蓋的小瓶中，倒入FAA固定液固定。

1.3 脫水與透明

1.3.1 脫水時間試驗設(shè)計

取出材料進行脫水，設(shè)3個處理水平，每個處理4段莖段。

處理1：70%乙醇(1.5 h)→85%乙醇(1.5 h)→95%乙醇(過夜)→無水乙醇Ⅰ(1.5 h)→無水乙醇Ⅱ(1.5 h)；

處理2：除在95%乙醇過夜同處理1外，其余每階段均設(shè)置為2 h；

處理3：除在95%乙醇過夜同處理1外，其余每階段均設(shè)置為2.5 h。

處理后放入二甲苯中檢測脫水效果。

1.3.2 透明時間試驗設(shè)計

將脫水干凈又不皺縮的材料設(shè)置3個處理水平，每個處理4段根狀莖。

處理1：按參考文獻[8]中二甲苯作為透明劑的透明步驟進行透明，每個階段均設(shè)置為6 h；

處理2:每個階段均設(shè)置為8 h；

處理3：每個階段均設(shè)置為10 h。

處理后切片檢測透明效果。

1.4 浸蠟與包埋

1.4.1 浸蠟時間試驗設(shè)計

取透明成功的材料設(shè)置3個處理水平，每個水平4段根狀莖。

處理1：盛有材料的小杯中倒出1/3的二甲苯倒入1/3的熔蠟，加蓋放在35℃恒溫箱中(8 h)→50℃恒溫箱(8 h)→去蓋置于60℃恒溫箱(8 h)→倒出1/2的溶液倒入1/2的蠟置于60℃恒溫箱(8 h)→倒出2/3的溶液倒入2/3的蠟置于60℃恒溫箱(8 h)→倒出所有溶液放入純蠟置于60℃恒溫箱(8 h)；

處理2：每個階段均設(shè)置為10 h；

處理3：每個階段均設(shè)置為12 h。

1.4.2 包埋

按參考文獻[7]中包埋方法進行包埋。

1.5 切片、粘片

按參考文獻[7]中切片方法進行切片(切片厚度為14 μm)，檢測浸蠟效果。將完整的蠟片按參考文獻[7]中粘片方法進行展片，將其放在45℃左右恒溫箱內(nèi)烤干[9]。

1.6 脫蠟和復(fù)水

按參考文獻[9]中脫蠟和復(fù)水步驟進行。

1.7 染色、脫水

采用番紅—固綠對染法[7]，復(fù)水之后放入番紅溶液中染色(24 h)→50%乙醇(5 min)→70%乙醇(5 min)→85%乙醇(5 min)→固綠溶液(1.5 min)→95%乙醇(5 min)→無水乙醇Ⅰ(5 min)→無水乙醇Ⅱ(3 min)

1.8 透明和封片

切片從無水乙醇Ⅱ中取出放入1/2二甲苯+1/2純酒精(5 min)→二甲苯Ⅰ(5 min)→二甲苯Ⅱ(5 min)→滴一滴中性樹膠→封片→35℃烘箱中烘干。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同脫水時間對材料脫水效果的影響

由表1可以看出，處理1脫水不完全，二甲苯遇水變成乳白色，且有兩段材料出現(xiàn)凹陷。若原材料中的水分不能完全除凈，包埋劑和封固劑就不能滲透到組織中，也就不能制作出完整的石蠟切片。而處理3材料出現(xiàn)硬化，脫水過度，3段材料邊緣出現(xiàn)褐色，材料硬化后切片時不能形成完整蠟片。處理2脫水時間段比較適宜，有利于完整切片的制作。

表1 不同脫水時間對材料脫水效果的影響

2.2 不同透明時間對材料透明效果的影響

從表2和圖1A可以看出，處理1由于透明時間不足，透明感不明顯，二甲苯未完全浸入材料，致使包埋劑不能完全滲入組織當(dāng)中，切片出現(xiàn)皺縮或空洞。處理3和圖1C透明過度，引起組織收縮變脆，出現(xiàn)較多碎裂和脫落，切片不完整。圖1B切片清晰完整，表明處理2的透明時間適宜，切片完整無損。

表2不同透明時間對材料透明效果的影響

Table2 The transparent situation of material in different transparent time

處理Treats通透情況Transparent case切片完整情況Intact conditionof paraffin處理1(每階段6 h)不通透皺縮處理2(每階段8 h)通透完整處理3(每階段10 h)通透碎裂

圖1 不同透明時間對切片效果的影響Fig.1 The effect of different transparent time on result of paraffin section注：A.處理1制作出的石蠟切片;B.處理2制作出的石蠟切片;C.處理3制作出的石蠟切片。Note:A.The paraffin section of first treat; B.The paraffin section of second treat;C.The paraffin section of third treat.

2.3 不同浸蠟時間對切片效果的影響

從表3和圖2A看出，處理1浸蠟時間不足，切片有皺褶和破碎、空洞現(xiàn)象，由于浸蠟時間太短，石蠟還不能完全代替二甲苯，切出的蠟帶稍碰即碎。處理3經(jīng)過每級停留12 h的時間，浸蠟時間過長，引起組織硬脆，圖2C不完整，出現(xiàn)不同程度的破碎。處理2浸蠟時間為10 h，較為適宜，二甲苯完全揮發(fā)，石蠟完全浸入，圖2B中蠟帶完整，切片清晰。

表3 不同浸蠟時間對切片效果的影響

圖2 不同浸蠟時間對切片效果的影響Fig.2 The effect of different dipping wax time on result of paraffin section注：A.處理1制作出的石蠟切片;B.處理2制作出的石蠟切片;C.處理3制作出的石蠟切片。Note:A.The paraffin section of first treat;B.The paraffin section of second treat; C.The paraffin section of third treat.

2.4 材料的顯微結(jié)構(gòu)特點

從圖3A和B可看出，維管束較多且無規(guī)則地分散在組織中，外圍表皮(B)的維管束要比中間部位(A)的維管束密集，無明顯的髓結(jié)構(gòu)，有初生木質(zhì)部、初生韌皮部。圖3C為邊緣一側(cè)細胞較為密集和結(jié)構(gòu)較為特殊的一個部位，向外凸起，初步判斷為不定根原基。

從圖4A和B可以看出，木質(zhì)部和韌皮部內(nèi)外排列，沒有形成層。木質(zhì)部和韌皮部呈兩個相反的方向分化，即韌皮部外始式分化和木質(zhì)部內(nèi)始式分化。符合植物莖的一般特征。圖4C為基本組織放大后的圖像，中間有紅色顆粒物，初步判斷為淀粉粒。

通過對切片的顯微觀察，維管束排列方式及木質(zhì)部、韌皮部的分化特點等都符合單子葉植物莖的一般特征，證實山藥地下食用部分為變態(tài)莖。

圖3 10×10倍鏡下材料不同部位顯微結(jié)構(gòu)Fig.3 10 × 10 magnification in the different parts of the material microstructure注：A.中間含維管束部位； B.外圍周皮部位;C.邊緣不定根原基部位。Note:A Containing vascular bundles site in the middle; B.Peripheral periderm site；C.Edge adventitious root primordia site.

圖4 10×40倍鏡下材料不同部位顯微結(jié)構(gòu)Fig.4 10 × 40 magnification in the different parts of the material microstructure注：A .某一維管束結(jié)構(gòu)B .某一維管束結(jié)構(gòu)C .基本組織及淀粉粒結(jié)構(gòu)。Note:A. A vascular bundle structure；B.A vascular bundle structure；C.Basic organizational and starch grain structure.

3 結(jié)論與討論

3.1 制作方法

應(yīng)用酒精脫水時，應(yīng)逐步進行，不可太快，否則會使細胞收縮。開始脫水時先用濃度較低的酒精，然后逐漸增加濃度以至純酒精，一般各級酒精濃度為50%、70%、85%、95%、100%[7]。由于配制FAA固定液時是用70%的酒精，所以脫水時從70%酒精開始脫水不會產(chǎn)生影響，同時可以節(jié)約時間和試劑。

浸蠟過程中溫度過高會引起材料變脆，通常不能高出熔點2℃，并且夏季要適當(dāng)降低溫度。通常粘片時需要使用明膠粘貼劑，但是如果載玻片夠干凈，用蒸餾水也可進行粘片，不過不同蒸餾水的粘貼效果會有所不同。

3.2 顯微結(jié)構(gòu)分析

絕大多數(shù)單子葉植物莖維管束很清楚的分開，一般有兩種排列方式：一種是維管束全都無規(guī)則的分散在基本組織中，愈向外愈多，皮層和髓很難分辨；另一種是維管束排列較規(guī)則，一般呈兩圈，中央為髓[10]。單子葉植物的根通常沒有次生結(jié)構(gòu)，僅由初生結(jié)構(gòu)組成，且維管束占整個根結(jié)構(gòu)的比重較小，處在中間部位，內(nèi)皮層五面加厚。從圖3A和B可以看出，其符合單子葉植物莖的一般特點，因而將其判定為莖。

木質(zhì)部和韌皮部內(nèi)外排列，無形成層,維管束中韌皮部外始式分化和木質(zhì)部內(nèi)始式分化是大多數(shù)單子葉植物莖的結(jié)構(gòu)特征之一[10]。單子葉植物根木質(zhì)部和韌皮部相間排列且均為外始式發(fā)育。從圖4A和B可以看出，材料的木質(zhì)部和韌皮部的分化方式都符合單子葉植物莖的分化方式，由此推斷其為莖。

此試驗所用的牛尾山藥所需的透明和浸蠟時間較長，可能與其所含淀粉較多有關(guān)，圖4C中可看到一些淀粉粒，一般染色時淀粉不著色，但由于含量太多，部分淀粉已上了色。

膨大的變態(tài)莖有根狀莖和塊狀莖兩種，主要通過形狀來判斷。就山藥來說，如果呈棍棒狀，可稱為根狀莖，如著名的鐵棍山藥；如果呈塊狀或掌狀，可稱為塊狀莖，如廣州紅皮淮山藥，福建的觀音薯等。此研究材料牛尾山藥為棍棒狀，因此稱其為根狀莖。

參 考 文 獻

[1]中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會．中國植物志(第16(1)卷)[M]．北京：科學(xué)出版社，1985:54-55.

[2]黃文華．山藥無公害標(biāo)準(zhǔn)化栽培[M]．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005:1-3.

[3]周燕瓊，趙昶靈，李云，等．云南紫薯蕷塊根紫色素化學(xué)本質(zhì)和含量的初步研究[J]．江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2010(4)：183-185.

[4]杜廣平,魏樹成,杜振宇．土壤耕深對寒地山藥生長發(fā)育及產(chǎn)量的影響[J]．河南農(nóng)業(yè)，2011(7):70-72.

[5]侯春春，徐水．淺析影響石蠟切片質(zhì)量的關(guān)鍵因素[J]．中國農(nóng)學(xué)通報，2009,25(23)：94-98.

[6]王靜，左幸，黃正文.常規(guī)植物石蠟制片技術(shù)的改進及應(yīng)用[J].安徽農(nóng)學(xué)通報，2011,17(11)：36-39.

[7]李正理．植物制片技術(shù)[M]．北京：科學(xué)出版社，1978:23-139.

[8]段國祿,施江．植物制片、標(biāo)本制作和植物鑒定[M]．北京：氣象出版社，2008:6-14.

[9]趙云，李濤，陳增潔．含羞草石蠟切片的制作[J]．寧夏農(nóng)林科技，2011,52(04):45-46.

[10]賀學(xué)禮．植物學(xué)[M]．北京：科學(xué)出版社，2009：123-125.