文冠果腋芽誘導關鍵影響因素與培養(yǎng)體系優(yōu)化

張娜，張蕓香，郭晉平

(1.山西農業(yè)大學 林學院，山西 太谷 030801；2.山西省林業(yè)科學研究院，山西 太原 030012)

腋芽增生是指莖尖或初代培養(yǎng)的芽在適宜的培養(yǎng)基上誘導，不斷發(fā)生腋芽，腋芽又不斷萌發(fā)形成叢生苗，通過一代又一代地誘導腋芽發(fā)育，獲得大量再生植株的技術[1]。腋芽增生過程中不經歷脫分化階段而直接從芽發(fā)育成新芽，再生植株能夠最大限度地保持母本的優(yōu)良性狀，已成為木本植物無性系快速繁殖中運用最為廣泛的組培技術途徑。腋芽誘導是實現腋芽增生的首要和關鍵步驟，解決好腋芽增生技術體系中腋芽誘導環(huán)節(jié)的技術問題，是發(fā)揮腋芽增生方法的優(yōu)勢、實現無性系高效快繁的關鍵技術問題。

文冠果優(yōu)良品種和類型的選育是目前林業(yè)生產中亟待解決的問題，在優(yōu)良無性系選育中，實現無性系高效組培快繁是技術瓶頸，而文冠果屬于組織培養(yǎng)繁殖困難的樹種。文冠果組織培養(yǎng)體系的建立方面已開展了大量的探索和實驗工作，文冠果莖段外植體組織培養(yǎng)技術方面也有許多試驗研究[2～6]，但迄今為止，尚無文冠果莖段外植體腋芽誘導關鍵影響因素的明確研究結果，組培技術體系尚不完善。

以文冠果幼嫩莖段作為外植體，對滅菌劑種類及滅菌時間、外植體采集時間、基本培養(yǎng)基類型、BA濃度、糖源種類和濃度等文冠果腋芽誘導的可能影響因素進行了試驗研究，旨在掌握腋芽誘導的關鍵影響因素和作用規(guī)律，建立文冠果莖段外植體高效腋芽誘導技術體系，為突破文冠果大規(guī)模組培快繁關鍵技術難題，實現文冠果優(yōu)良品種繁育的突破提供理論依據與技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料采自課題組在山西農業(yè)大學林學院苗圃栽培的6年生文冠果實驗林，選擇植株生長健康的幼嫩莖段作為試驗所用的外植體材料。

將大田采回的莖段洗凈后，在超凈工作臺上操作，先用75%的酒精滅菌10～30 s，無菌水沖洗3次，再用實驗設計的2種滅菌劑進行不同時間的滅菌處理，無菌水沖洗5～6次，切成1.5 cm左右的莖段，每個莖段至少帶1個腋芽，準備接種。

1.2 試驗設計和培養(yǎng)條件

本研究分6個分項實驗，分別解決文冠果莖段增生組培腋芽誘導中的滅菌劑類型和滅菌時間、外植體采集時期、基本培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)基BA濃度、培養(yǎng)基糖源類型和濃度、培養(yǎng)環(huán)境光照條件共6個關鍵技術指標的選擇和組合優(yōu)化。

試驗采用單因素完全隨機設計，每處理均為30瓶，每瓶接種1個外植體，重復3次，接種培養(yǎng)時間4 w。

試驗的培養(yǎng)過程在全自動恒溫培養(yǎng)箱中進行，溫度為25±2℃；除培養(yǎng)環(huán)境光照條件實驗外，光照強度均為2500～3000 lx，光照時間為14～16 h·d-1；除培養(yǎng)基類型選擇試驗采用多種培養(yǎng)基外，其余試驗均采用MS培養(yǎng)基；除培養(yǎng)基糖源類型和濃度試驗外，培養(yǎng)基糖源均為蔗糖，濃度為30 g·L-1；所有培養(yǎng)基均添加瓊脂4.5 g·L-1，培養(yǎng)基調至pH 5.8～5.9。

1.3 滅菌劑及滅菌時間

試驗設計2種滅菌劑，分別為2%次氯酸鈉(NaClO)和0.1%氯化汞(HgCl2)。對2種滅菌劑均分別設計4個滅菌時間梯度，用2%NaClO滅菌時，滅菌時間梯度分別為5、8、10、12 min；用0.1%HgCl2滅菌時，滅菌時間梯度分別為2、3、4和5 min。采用4～5月采集的幼嫩莖段，經各項處理后進行接種培養(yǎng)，4 w后對文冠果莖段外植體的污染率、死亡率和成活率進行觀察統(tǒng)計。

1.4 外植體采集時間

為分析外植體采集時間和枝條木質化程度對莖段外植體組培滅菌效果的影響，設計4～9月中共6個外植體采集時間，選在每月中旬晴朗的中午，選擇當年生枝條采集文冠果莖段。由于采集時間、枝條木質化程度不同，不同的采集時間代表了不同的外植體木質化程度。不同時期采集的外植體及時經處理后接種培養(yǎng)，4 w后統(tǒng)計外植體的污染率、死亡率和成活率。

1.5 基本培養(yǎng)基

供選擇試驗的基本培養(yǎng)基為MS、B5和WPM，按試驗設計確定的試驗材料準備和培養(yǎng)條件，接種至3種培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，4 w后觀察腋芽生長情況，統(tǒng)計腋芽誘導率。

1.6 培養(yǎng)基BA濃度

采用上述篩選的最佳基本培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基,并添加0.2 mg·L-1NAA，再添加不同濃度的BA，設計BA濃度梯度為0.5、1.0、3.0和5.0 mg·L-1，接種培養(yǎng)4 w后，觀察文冠果腋芽生長情況，統(tǒng)計腋芽誘導率。

1.7 培養(yǎng)基糖源類型及濃度

采用上述篩選出的最佳基本培養(yǎng)基及激素組合作為該試驗的基本培養(yǎng)基，設計培養(yǎng)基糖源種類為蔗糖、葡萄糖和果糖3個，并分別設計3個濃度梯度：10、30、50 g·L-1。接種培養(yǎng)4 w后，觀察文冠果腋芽生長情況，統(tǒng)計腋芽誘導率。

1.8 培養(yǎng)環(huán)境的光照

采用上述篩選出的最佳基本培養(yǎng)基及激素組合作為該試驗的基本培養(yǎng)基，添加蔗糖30 g·L-1，瓊脂4.5 g·L-1，分別進行光照培養(yǎng)和黑暗培養(yǎng)。4 w后，觀察文冠果腋芽生長情況，統(tǒng)計腋芽誘導率。

1.9 數據統(tǒng)計與分析

將試驗所得數據采用SPSS17.0進行方差分析，并用Duncan多重比較方法對各處理間的均值進行差異顯著性檢驗。具體指標計算如下：

污染率=污染的外植體數/接種的外植體總數×100%

死亡率=死亡的外植體數/接種的外植總體數×100%

成活率=100%-污染率-死亡率

腋芽誘導率=[誘導出腋芽的外植體總數/(接種的外植體總數-污染的外植體數)]×100%

2 結果與分析

2.1 滅菌劑及滅菌時間對文冠果莖段外植體滅菌效果的影響

對滅菌劑和滅菌時間的方差分析表明，滅菌劑及滅菌時間對外植體的污染率、死亡率和成活率的影響極顯著。

由表1可見，采用2%NaClO作為滅菌劑，當滅菌時間為5 min時，污染率高達92.43%，雖然死亡率很低，但成活率僅為5.42%；隨著滅菌時間延長，污染率有所降低，但死亡率也相應升高；當滅菌時間為10 min時，污染率和死亡率分別為64.85%和15.38%，成活率最高，僅為19.77%；當滅菌時間繼續(xù)延長至12 min時，污染率降低為42.21%，但死亡率卻高達42.22%，其成活率也僅為15.57%。采用0.1% HgCl2作為滅菌劑，當滅菌時間為2 min時，污染率高達77.87%，成活率僅達14.31%；隨著滅菌時間的延長，污染率逐漸降低，死亡率逐漸升高；當滅菌時間為4 min時，污染率和死亡率均較低，成活率最高，達74.38%；當滅菌時間繼續(xù)延長為5 min時，污染率達最低，為12.16%，但死亡率很高，達45.66%，成活率僅為42.18%；如圖1-A為外植體莖段死亡，主要是由于滅菌時間過長所致。

可見，2%NaClO無論濃度如何，都不是文冠果莖段外植體的適宜滅菌劑，而0.1% HgCl2滅菌4 min是文冠果莖段外植體組培的適宜滅菌處理方式。

表1 滅菌劑及滅菌時間對莖段外植體滅菌效果的影響

注：每個值代表標準值±標準誤。所有數據在P=0.05水平采用鄧肯多重比較法進行比較；同一列中相同字母之間表示差異不顯著，不同字母之間表示差異顯著。表2～表6同。

Note: Each value represents the mean ± standard error. Data within a column followed by the same letter in superscript are not significantly different by Duncan's multiple-range test (P<0.05). The same as in table 2～table 6.

2.2 外植體采集時期對文冠果莖段外植體滅菌效果的影響

對外植體采集時間的方差分析表明，不同采集時期對外植體污染率和成活率的影響極顯著，對外植體的死亡率影響不顯著。4～5月采集外植體進行組培，污染率較低，分別為10.01%和14.92%，成活率最高，分別為80.06%和74.77%；6月采集外植體進行組培，污染率逐漸升高，成活率逐漸降低；至7～8月采集外植體，污染率達到最高，而成活率達到最低，分別為15.60%和12.07%；到9月采集外植體，污染率又有所降低，成活率有所升高，分別為42.68%和47.24%，如表2所示。

表2外植體采集時期對莖段外植體滅菌效果的影響

Table2 Effect of collection period on disinfection of stem segment explants

采集時期Collectionperiod污染率Pollutionrate/%死亡率Mortalityrate/%成活率Survivalrate/%4月10.01±1.93 c9.93±1.73 a80.06±1.54 a5月14.92±0.89 c10.31±1.93 a74.77±1.92 a6月42.40±3.39 b10.35±0.21 a46.09±3.78 b7月72.20±2.31 a12.19±0.93 a15.60±3.10 c8月77.88±1.08 a9.04±1.49 a12.07±1.54 c9月42.68±2.03 b11.23±1.06 a47.24±2.44 b

2.3 基本培養(yǎng)基類型對文冠果莖段組培腋芽誘導的影響

對基本培養(yǎng)基類型的腋芽誘導效果的方差分析表明，基本培養(yǎng)基類型對文冠果腋芽誘導率影響顯著。由表3可見，在供試驗的3種基本培養(yǎng)基中，MS基本培養(yǎng)基腋芽誘導率最高，達88.77%，腋芽萌發(fā)時間也較早，在第6～8 d即開始萌發(fā)(圖1-B)，之后葉片伸展較快，植株長勢良好，如圖1-C。B5和WPM培養(yǎng)基腋芽誘導率略低，且腋芽萌發(fā)時間較晚，均在8～10 d開始萌發(fā)。在B5培養(yǎng)基上進行外植體培養(yǎng)，葉片伸展較快，但植株長勢細弱(圖1-D)；在WPM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，植株長勢良好，但葉片伸展較慢(圖1-E)。

表3基本培養(yǎng)基類型對腋芽誘導的影響

Table3 Effect of basal medium on induction of axillary bud

基本培養(yǎng)基Basalmedium腋芽誘導率Inductionfrequency/%腋芽萌發(fā)期Germinationstage/d腋芽生長表現Growth situation MS88.77±2.92 a6～8良好,葉片伸展較快B579.60±1.59 b8～10細弱,葉片伸展較快WPM77.55±2.12 b8～10良好,葉片伸展較慢

2.4 培養(yǎng)基BA濃度對文冠果腋芽誘導的影響

對培養(yǎng)基BA濃度的腋芽誘導效果的方差分析表明，培養(yǎng)基BA濃度對文冠果腋芽誘導率影響顯著。由表4可見，當BA濃度為0.5 mg·L-1時，腋芽誘導率達83.36%，腋芽在培養(yǎng)5～7 d后萌發(fā)，且生長較慢；將BA濃度提高到1.0 mg·L-1時，腋芽誘導率達92.25%，腋芽培養(yǎng)4～5 d后開始萌發(fā)，且腋芽生長較快；繼續(xù)提高BA濃度到3.0 mg·L-1時，腋芽誘導率略有下降，腋芽培養(yǎng)4～5 d后萌發(fā)，腋芽生長較快，但出現輕微玻璃化現象(圖1-F)；當BA濃度為5.0 mg·L-1時，腋芽誘導率最低，且玻璃化現象嚴重。

2.5 糖源類型及濃度對文冠果腋芽誘導的影響

對糖源類型及濃度的腋芽誘導效果的方差分析表明，糖源類型及濃度對文冠果腋芽誘導率的影響極顯著。培養(yǎng)基中3種糖源的3個糖含量梯度指標中均以30 g·L-1為最佳，腋芽誘導率達最高。

由表5可見，在3種糖源中，在3個相同濃度下，添加蔗糖的培養(yǎng)基腋芽誘導率均顯著高于添加其它2種糖源的培養(yǎng)基，而添加葡萄糖和果糖的培養(yǎng)基，腋芽誘導率差異不顯著。

表4培養(yǎng)基BA濃度對腋芽誘導的影響

Table4 Effect of different concentrations of BA on induction of axillary bud

BA/mg·L-1腋芽誘導率Inductionfrequency/%腋芽萌發(fā)期Germinationstage/d腋芽生長表現Growth situation0.583.36±1.81 b5 ～ 7 較慢1.092.25±0.97 a4 ～ 5較快3.081.94±3.67 b4 ～ 5較快,伴有輕微玻璃化現象5.068.94±2.29 c4 ～ 5較快,玻璃化現象嚴重

表5糖源類型及濃度對腋芽誘導率的影響

Table5 Effect of different types and concentrations of sugar on the frequency of auxiliary bud induction

糖源Type of sugar濃度Concentration/g·L-1腋芽誘導率Induction frequency/%蔗糖1083.36±1.73 b3092.26±2.93 a5072.34±2.05 c葡萄糖10 71.09±2.27 c30 80.99±3.28 b50 68.01±2.30 c果糖10 67.75±1.29 c30 80.99±3.28 b50 63.27±2.41 c

2.6 光照培養(yǎng)環(huán)境對文冠果腋芽誘導的影響

對光照培養(yǎng)環(huán)境的腋芽誘導效果的方差分析表明，光照培養(yǎng)和黑暗培養(yǎng)對文冠果腋芽誘導率影響不顯著，但不同光照培養(yǎng)環(huán)境下腋芽生長狀況存在差異。由表6可見，光照培養(yǎng)條件下，腋芽4～5 d開始萌發(fā)，生長較快，葉片呈綠色；在黑暗培養(yǎng)條件下，腋芽萌發(fā)較晚，在6～8 d開始萌發(fā)，生長較慢，葉片呈淡綠色甚至白色(圖1-G)，出現白化或黃化苗(圖1-H)，說明光照培養(yǎng)環(huán)境有利于莖段外植體腋芽誘導及生長。

表6光照培養(yǎng)環(huán)境對腋芽誘導的影響

Table6 Effect of light condition on induction of axillary bud

光照環(huán)境Lightcondition腋芽誘導率Inductionfrequency/%腋芽萌發(fā)期Germinationstage/d腋芽生長表現Growth situation 光照培養(yǎng)93.36±3.13 a4 ～ 5 良好,生長較快黑暗培養(yǎng)90.83±1.57 a6 ～ 8 生長較慢,出現白化或黃化苗

圖1 文冠果幼嫩莖段外植體的腋芽誘導生長情況Fig.1 Axillary bud induction using young stem segments as explants of Xanthoceras sorbifolia注：A，莖段死亡；B，培養(yǎng)6 d時，腋芽開始萌發(fā)；C，在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d后的腋芽生長情況；D，在B5培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d后的腋芽生長情況；E，在WPM培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d的腋芽生長情況；F，在添加3.0 mg·L-1 BA和0.2 mg·L-1 NAA的MS培養(yǎng)基上觀察到腋芽有輕微玻璃化現象；G & H，黑暗培養(yǎng)環(huán)境下，觀察到腋芽呈淡綠白色或淡黃白色。Note:A，Stem segment died; B，Axillary bud began to sprout when cultured for 6 d; C，Axillary bud cultured on MS medium for 30 d; D，Axillary bud cultured on B5 medium for 30 d; E，Axillary bud cultured on WPM medium for 30 d; F，The slight hyperhydric buds observed on MS medium supplemented with 3.0 mg·L-1 BA and 0.2 mg·L-1 NAA; G &H，The light white or light yellow buds observed when cultured on dark condition.

3 結論與討論

有效控制外植體污染是植物組織培養(yǎng)成功的先決條件。植物組織培養(yǎng)中常用的滅菌劑有漂白粉、次氯酸鈉(2%～10%)、氯化汞(0.1%～1%)和酒精(70%～75%)等[7]。適宜的滅菌劑既要有良好的滅菌效果，又要對外植體的損傷較小，還要易清洗，殘留少。因此，需要針對樹種、外植體類型和取材時期等正確選擇滅菌劑類型和處理時間。本研究選用了兩種滅菌劑，并分別設置了4個時間梯度進行篩選研究。結果表明，2%NaClO無論濃度如何，都不是文冠果莖段外植體的適宜滅菌劑，而0.1% HgCl2滅菌處理4 min是文冠果莖段外植體組培的適宜滅菌處理方式。Raha and Roy[8]在對止瀉木莖段外植體進行滅菌時，也采用0.1% HgCl2作為滅菌劑。HgCl2是重金屬，對環(huán)境危害大，對人畜的毒性極強，用時需慎重，使用后必須做好回收工作。

植物采集時期對外植體的滅菌效果也不盡相同。結果表明，4～5月采集的外植體易于滅菌，污染率較低，成活率最高，可能是由于4～5月是文冠果自然萌發(fā)的季節(jié)，腋芽處于萌動狀態(tài)，并且經過一個寒冷的冬季，外界環(huán)境中的各種病菌和病蟲害較少，易于滅菌。而7～8月正值雨季，空氣相對濕度大，加之高溫導致文冠果病害嚴重，致使外植體滅菌非常困難，此時期的污染率很高。在三倍體毛白楊的腋芽誘導試驗研究中也發(fā)現，5月份采集的外植體滅菌效果最好[9]。蘋果在3～6月采集的成活率可達60%，而7～11月采集時，其成活率降到10%[1]。

基本培養(yǎng)基的選擇直接影響植物組織培養(yǎng)的效果。結果表明，在MS基本培養(yǎng)基中，文冠果腋芽誘導率最高，達88.77%，而且腋芽在6～8 d即開始萌發(fā)，葉片伸展較快，植株長勢良好。而B5和WPM培養(yǎng)基的腋芽誘導率略低，且腋芽均在8～10 d萌發(fā)?？赡苁怯捎贛S基本培養(yǎng)基中的無機鹽含量高，尤其是硝酸鹽、銨離子和鉀離子含量豐富，易于文冠果腋芽誘導及生長[7]。Jiménez等[10]試驗發(fā)現，MS培養(yǎng)基是瓜多竹腋芽誘導的最佳基本培養(yǎng)基。

基本培養(yǎng)基需要配合使用適當的植物生長調節(jié)劑才能誘導細胞分裂的啟動、培養(yǎng)物形態(tài)建成、芽和根的分化與發(fā)育等[11]。本試驗對不同濃度的BA與0.2 mg·L-1NAA組合進行研究，結果表明，當BA濃度為1.0 mg·L-1時，腋芽誘導率最高，是文冠果腋芽誘導的最佳濃度。Yan等[12]對山藥進行腋芽誘導研究時發(fā)現，培養(yǎng)基中添加1.0 mg·L-1BA與NAA組合是山藥腋芽誘導的最佳培養(yǎng)基。

在植物組織培養(yǎng)中，糖類既為培養(yǎng)物提供能量，也是培養(yǎng)物滲透環(huán)境的主要調節(jié)者。蔗糖作為碳源和滲壓劑的比例約為3∶1～3∶2，即約有1/4～2/5的蔗糖用于保持培養(yǎng)基的滲透壓[13]。本研究表明，當蔗糖濃度為30 g·L-1時，是文冠果腋芽誘導的最佳濃度。

參 考 文 獻

[1]劉欣,薛金芝,趙丹,等.植物組織培養(yǎng)技術在林木育種中的應用[J].吉林林業(yè)科技,2007,36(3):8-13.

[2]張桂琴,徐祥齡,趙志學.文冠果嫩莖組織誘導植株移栽初獲成功[J].林業(yè)科技通訊,1980,7:4-5.

[3]王永明,趙靜茹,陳穎.文冠果的組織培養(yǎng)[J].植物生理學通訊,1986,1:42.

[4]王玉珍,李霞,張弛.文冠果組培快速繁殖方法[P].中國專利:CN 101032226,2007-9-12.

[5]柳金鳳,吳建華,閔麗霞.文冠果組培快繁技術研究[J].江蘇農業(yè)科學,2010：252-254.

[6]蘭士波,崔云英,李秀蘭.文冠果優(yōu)異種質選擇及莖段離體培養(yǎng)技術[J].黑龍江生態(tài)工程職業(yè)學院學報,2011,24(3):16-18.

[7]王蒂.植物組織培養(yǎng)[M].北京:中國農業(yè)出版社,2004:29-29.

[8]Raha S,Roy S C.In vitro plant regeneration in Holarrhena antidysenterica Wall,through high-frequency axillary shoot proliferation[J].In Vitro Cell Dev Biol-Plant,2001,37:232-236.

[9]李景琦,胡曉莉,王成社,等.不同激素對三倍體毛白楊腋芽誘導和增殖效應的研究[J].西北林學院學報,2002,17(2):37-40.

[10]Jiménez V M,Castillo J,Tavares E,et al.In vitro propagation of the neotropical giant bamboo,Guadua angustifolia Kunth,through axillary shoot proliferation[J].Plant Cell Tiss Organ Cult,2006,86:389-395.

[11]譚文澄,戴策剛.觀賞植物組織培養(yǎng)[M].北京:中國林業(yè)出版社,1991:117-117.

[12]Yan H,Yang L,Li Y.Axillary shoot proliferation and tuberization of Dioscorea fordii Prain et Burk[J].Plant Cell Tiss Organ Cult,2011,104:193-198.

[13]丁世萍,嚴菊強,季道藩.糖類在植物組織培養(yǎng)中的效應[J].植物學通報,1998,15(6):42-46.