核桃殼提取物體外抗氧化活性研究

郭瑜，郝慧娟，王曉聞，任志遠(yuǎn)

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801)

核桃又名胡桃，具有很高的營養(yǎng)價值，在我國種植范圍較廣。山西是核桃的主要產(chǎn)區(qū)之一，有著豐富的核桃資源。近年來，隨著核桃產(chǎn)品的大力開發(fā)產(chǎn)生了大量的核桃殼(約4～5×104t·y-1)[1]。核桃殼質(zhì)地堅硬，可用于生產(chǎn)木炭、活性炭及過濾劑等[2～4]，目前核桃殼主要是被當(dāng)做燃料使用，利用價值較低，有待進一步研究開發(fā)。

過多的自由基損害機體，研究認(rèn)為，氧自由基是體內(nèi)重要的一類活性自由基，包括O2-·、·OH、ROO·、RO·等。一般情況下，機體內(nèi)的自由基能夠進行正常的生理代謝，但當(dāng)機體在非正?；蚴遣∽儬顟B(tài)時，整個系統(tǒng)處于失衡的狀態(tài)，自由基會使機體內(nèi)大分子物質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)和整體機能造成損壞，導(dǎo)致機體損傷，從而引起衰老及慢性疾病[5,6]。

胡博璐等[7]研究表明核桃殼的水提物可以有效的清除·OH；核桃殼的水、乙酸乙酯、正己烷提取物對亞油酸脂質(zhì)過氧化具有抑制作用，表明核桃殼中存在抗氧化成分。張海珠等[8]對核桃殼NaOH提取物的研究表明，核桃殼中具有抑菌、殺菌成分。藍(lán)晶晶等[9]研究表明核桃殼黑色素具有清除DPPH·、·OH、O2-·的能力。目前對核桃殼乙醇提取物的研究較少，因此以核桃殼醇提物及其氯仿相為研究對象，通過提取物對DPPH·、·OH、H2O2、O2-·的清除能力及總還原力的測定，對提取物的體外抗氧化能力進行評估。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

材料：核桃殼(山西省長治市平順縣)，經(jīng)晾干后粉碎得到核桃殼粉末。

試劑：鄰苯三酚、硫酸亞鐵、水楊酸、鐵氰化鉀、氯化鐵、氯化亞鐵、無水甲醇、氯化鉀、30%雙氧水(北京化工，分析純)；三氯乙酸、三氯甲烷、冰乙酸(天津市精細(xì)化工研究所，分析純)；氯仿(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純)；二苯代苦味酰肼自由基(DPPH·，美國Sigma公司)。

主要儀器：2100分光光度計(尤尼柯上海儀器公司)、R201D-11旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (鄭州長城科工貿(mào)有限公司)、SHZ-III型循環(huán)水真空泵(上海亞榮生化儀器廠)

1.2 試驗方法

1.2.1 核桃殼醇提物與氯仿相制備

核桃殼干燥后磨碎，以95%乙醇為浸提劑，按照料液比1∶24，浸提溫度45℃，超聲波功率250 W浸提1.4 h，過濾并減壓濃縮，得乙醇提取物。提取物中加入一定量的蒸餾水，攪拌使其均勻分散，氯仿萃取，得氯仿相，減壓濃縮。用甲醇將核桃殼乙醇浸膏和氯仿浸膏溶解，配制成不同濃度樣液。

1.2.2 提取物對DPPH·清除能力

2.0 mL樣液分別加入2.0 mL 0.125 mmol·L-1DPPH·(Sigma)和2.0 mL無水甲醇，搖勻，避光反應(yīng)30 min，在517 nm處測定反應(yīng)液的吸光度Ai、Aj；2.0 mL 0.125 mmol·L-1DPPH·加入甲醇2.0 mL，搖勻，避光反應(yīng)30 min，在517 nm處測定反應(yīng)液的吸光度A0。計算對DPPH·的清除率：

清除率/%=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

1.2.3 提取物的總還原能力

1 mL提取物中加入0.2 mol·L-1pH 6.6的磷酸緩沖溶液2.5 mL和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的鐵氰化鉀2.5 mL，50℃水浴20 min。冰浴急速冷卻后，加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，3000 r·min-1離心10 min，取上清液1.0 mL，加入蒸餾水1.0 mL和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1 % FeC130.2 mL，混勻，室溫靜置10 min，于波長700 nm處測定吸光度值，吸光度值越大則還原力越強。

1.2.4 提取物對H2O2清除能力

5 mL提取物中加入等量10 mmol·L-1的H2O2溶液(pH 7.4磷酸緩沖液為溶劑)混勻，230 nm處測吸光度值A(chǔ)1；以等量甲醇代替提取物測吸光度值A(chǔ)0；以等量磷酸緩沖液代替H2O2溶液測吸光度值A(chǔ)2。計算對H2O2清除能力：

清除率/%=[1-(A1-A2)/A0]×100%

1.2.5 提取物對·OH清除能力

按照表1加入反應(yīng)試劑，搖勻，放入37℃水浴鍋60 min后取出，于510 nm處測其吸光度值，計算對·OH的清除能力：

清除率/%=[1-(AX-AX0)/A0]×100%

表1 ·OH反應(yīng)體系加樣表

1.2.6 提取物對O2-·清除能力

100 μL樣品液中加入0.1 mol·L-1的Tris-HCl緩沖液(pH 8.2，含4 mmol·L-1的EDTA)1.8 mL、1 mL雙蒸水，25℃水浴保溫10 min，加入25℃、3 mmol·L-1的鄰苯三酚100 μL，迅速混合混勻，每隔30 s測定在325 nm處的吸光度值。以10 mmol·L-1的鹽酸溶液配制空白管作為對照，測吸光度值。作吸光度隨時間變化的回歸方程，其斜率為鄰苯三酚自氧化速率V，計算對O2-·的清除能力：

清除率/%=[(V對照-V樣本)/V對照]×100%

式中：V對照-對照組鄰苯三酚自氧化速率/ΔA·min-1；V樣本-樣品組鄰苯三酚自氧化速率/ΔA·min-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取物對DPPH·清除能力

由圖1可見，核桃殼乙醇提取物和氯仿提取物對DPPH·自由基均有清除能力且清除能力隨濃度的增加而增大。當(dāng)溶液濃度在1 mg·mL-1以下時，醇提物對DPPH·的清除能力比氯仿相強。當(dāng)溶液濃度達到1 mg·mL-1以上時，氯仿相的清除能力高于醇提物。在試驗最大濃度2 mg·mL-1時，醇提物和氯仿相對DPPH·的清除2 mg·mL-1率分別達到84.91%和93.42%。

圖1 提取物對DPPH·自由基的清除能力Fig.1 Scavenging ability of extracts on DPPH·

2.2 提取物總還原力的測定

由圖2可見，核桃殼醇提物和氯仿相有一定的還原能力，且隨濃度的增加還原能力增強。當(dāng)樣品濃度為2 mg·mL-1時，核桃殼乙醇提取物和氯仿相的還原力的吸光度分別達到1.971和0.998。

圖2 提取物的還原能力Fig.2 Reducing power of extracts

2.3 提取物對H2O2清除能力

由圖3可見，提取物對H2O2有一定的清除能力，且隨濃度的增加清除能力增強。當(dāng)濃度大于0.5 mg·mL-1時氯仿相對H2O2的清除率高于Vc和醇提物。當(dāng)溶液濃度為2 mg·mL-1時，醇提物和氯仿相的清除率分別達到了33.54%和47.58%。

圖3 提取物對H2O2清除能力Fig. 3 Scavenging ability of extracts on H2O2

2.4 提取物對·OH自由基清除能力

由圖4可見，提取物具有清除·OH的能力，且隨濃度的增加清除能力逐漸增強。當(dāng)試驗濃度達到2 mg·mL-1時，醇提物和醇提物氯仿相的清除率分別達到了22.98%和49.89%。在試驗濃度范圍內(nèi)醇提物氯仿相的清除能力高于醇提物。

圖4 核桃殼乙醇和氯仿提取物對·OH自由基清除能力Fig.4 Scavenging capacity of extracts on ·OH

2.5 提取物對O2-·清除能力

由圖5可見，提取物具有清除O2-·的能力。當(dāng)濃度為2 mg·mL-1時，醇提物和醇提物氯仿相的清除率分別為80.36%和90.64%。

圖5 提取物對O2-·清除能力Fig.5 Scavenging capacity of extracts on O2-·

3 結(jié)論與討論

3.1 體外抗氧化活性研究

二苯代苦味酰肼自由基(DPPH·)在517 nm處有最大吸收波長，其機理是釋放質(zhì)子，釋放之后會形成一種穩(wěn)定的反磁性分子。如果受試物能夠清除DPPH·，便可以迅速的評價此受試物的抗氧化能力[6,10]。清除O2-·和·OH是抗氧化劑發(fā)揮抗氧化作用的主要機制。H2O2正常情況下在人的機體內(nèi)不會發(fā)生化學(xué)變化，但一旦與羥基結(jié)合就會破壞人體的正常生理功能[11]。本試驗結(jié)果顯示在試驗濃度范圍內(nèi)核桃殼乙醇相和氯仿相均對DPPH·、O2-·、·OH和H2O2有一定的清除能力，尤其對DPPH·和O2-·有較強的清除作用，而對·OH和H2O2清除作用不明顯。

還原力是表示物質(zhì)抗氧化能力的標(biāo)志之一。溶液的吸光度越大，還原力也就越強，即抗氧化性也隨之增強[12]。本試驗結(jié)果表明核桃殼提取物在一定濃度下具有還原能力，在低濃度下還原能力比較低，隨著濃度的增加，其還原能力逐漸上升。

在試驗濃度范圍內(nèi)，核桃殼乙醇提取物和氯仿相對DPPH·、O2-·、·OH、H2O2的清除能力和還原能力與樣品的濃度成正相關(guān)。本研究表明核桃殼乙醇提取物及氯仿相具有體外抗氧化能力。鑒于核桃殼多被棄置，如能從中提取活性成分，則可變廢為寶，更充分、合理地利用資源。

3.2 核桃殼醇提物中的成分

盧四平等[13]人對核桃殼提取物的化學(xué)成分分析表明，核桃殼中含有有機酸、酚、酮等化合物，并含有一定的胡桃醌。孫墨瓏[14]對核桃楸的醇提物進行了研究，確認(rèn)了其中的活性成分主要為黃酮與胡桃醌。核桃與核桃楸同屬胡桃屬，因此根據(jù)孫墨瓏與盧四平的研究推測本研究中核桃殼乙醇提取物中可能存在黃酮、胡桃醌。黃酮[15～17]具有抗氧化活性；胡桃醌具有抑菌[18,19]、抗腫瘤[20]等活性。核桃殼乙醇提取物表現(xiàn)出的體外抗氧化活性可能與其中黃酮、胡桃醌的存在及含量有關(guān)，具體需進一步研究驗證。

參 考 文 獻

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