不同組培方式對(duì)花生子葉離體組培獲得再生苗影響的研究

盧春生，廖福琴，林蕓

(福建省龍巖市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福建 龍巖 364000)

花生屬于無(wú)限開(kāi)花結(jié)實(shí)的作物，生育期較長(zhǎng)，大多數(shù)經(jīng)濟(jì)性狀都是數(shù)量性狀，受多基因控制，遺傳基礎(chǔ)比較狹窄, 缺乏相關(guān)的抗性基因[1]。其栽培種在長(zhǎng)期的種植過(guò)程中，往往由于機(jī)械混雜、生物學(xué)混雜(天然雜交)、不同自然條件和栽培條件的影響、多種病蟲(chóng)害的侵入、品種本身遺傳性發(fā)生變化和自然雜交以及干旱等災(zāi)害的影響[2], 引起基因重組而產(chǎn)生變異，造成品種混雜，種性退化，豐產(chǎn)性變劣，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)[3]。目前在花生的種性保持中，基本采用株選、莢選、仁選等措施，而且都是在室外或田間進(jìn)行，極易受客觀條件的限制引起再次混雜，因此為了保持品種的固有特性，充分發(fā)揮品種的優(yōu)良特性，根據(jù)雷萍萍等以花生組織培養(yǎng)及高頻率植株再生成功的報(bào)道[4，5]，開(kāi)展了利用種仁中的子葉作為外植體，采用不同的培養(yǎng)基進(jìn)行離體組織培養(yǎng)獲得再生植株，再用不同的基質(zhì)種植幼苗移到室外煉苗，使花生幼苗生長(zhǎng)適應(yīng)外界的環(huán)境條件后再定植，從而不受外界條件的影響，以保持品種的遺傳性狀和農(nóng)藝性狀的一致性，延長(zhǎng)優(yōu)良品種的使用壽命，一般可增產(chǎn)10%左右[6]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

咸酥花生加工型花生品種“龍花163”的種仁(該品種于2007年通過(guò)福建省認(rèn)定)。

1.2 培養(yǎng)條件

采用MS基本培養(yǎng)基，附加不同種類(lèi)和濃度的激素。培養(yǎng)溫度為25±3℃，光照強(qiáng)度為1500～2000 LX。光照時(shí)間14 h·d-1，蔗糖用量為30 g·L-1，瓊脂7 g·L-1，pH值為5.4～5.8。

1.3 離體組織培養(yǎng)

1.3.1 愈傷組織的誘導(dǎo)

選取飽滿(mǎn)，無(wú)病蟲(chóng)害，無(wú)萌芽破皮的種仁，將種仁浸泡1～2 h，置于光照培養(yǎng)箱進(jìn)行催芽。2 d后取出催芽后的種子，放在超凈工作臺(tái)，經(jīng)體積濃度為70%酒精中浸泡15 s，再置0.1% HgCl2溶液消毒15 min后,用無(wú)菌水沖洗5～7次，剝?nèi)シN皮去掉胚軸、胚葉留下子葉，將子葉節(jié)端插入5種處理進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)。

處理1：MS+6-BA 4 mg·L-1+2,4-D 1 mg·L-1;

處理2：MS+6-BA 4 mg·L-1+2,4-D 2 mg·L-1;

處理3：MS+6-BA 4 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1;

處理4：MS+6-BA 4 mg·L-1+NAA 1 mg·L-1;

處理5：MS+6-BA 4 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+2,4-D 1 mg·L-1.

1.3.2 愈傷組織的分化

當(dāng)愈傷組織生長(zhǎng)50 d左右，從外植體上切下，轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基進(jìn)行分化試驗(yàn)。

處理1：MS+6-BA 1 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1;

處理2：MS+6-BA 1 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1;

處理3：MS+6-BA 1 mg·L-1+NAA 1 mg·L-1;

處理4：MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1;

處理5：MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1;

處理6：MS+6-BA 2 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1.

1.3.3 根的誘導(dǎo)

當(dāng)分化長(zhǎng)至數(shù)片真葉約3 cm后，從愈傷組織上切下，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基：

(1) 1/2MS；

(2)1/2MS+IBA 0.5 mg·L-1；

(3)1/2MS+IBA 1 mg·L-1；

(4)1/2MS+IBA 1.5 mg·L-1；

(5)1/2MS+NAA 0.5mg·L-1；

(6)1/2MS+NAA 1mg·L-1上；

(7)1/2MS+NAA 1.5 mg·L-1，誘導(dǎo)生根。

1.3.4 組培苗移栽

將已生根的組培苗搬到室外進(jìn)行煉苗。7 d后洗去瓊脂，在2‰托布津溶液浸泡20 min，晾干后，種植于事先滅過(guò)菌的基質(zhì)上?；|(zhì)采用：(1)腐質(zhì)土；(2)珍珠巖；(3)蛭石；(4)蛭石∶腐質(zhì)土=1∶1。溫度保持25±2℃，濕度>80%，植株成活后大約15 d左右，將組培苗移栽到大田定植。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素濃度對(duì)花生子葉愈傷誘導(dǎo)的影響

從表1可以看出,5種培養(yǎng)基都能成功誘導(dǎo)愈傷組織發(fā)生，這說(shuō)明愈傷組織的誘導(dǎo)不受生長(zhǎng)素種類(lèi)的限制[6]，但處理1培養(yǎng)基中的愈傷組織較松散，透明；處理2培養(yǎng)基中愈傷組織半透明，基部已經(jīng)褐化變黑；處理3培養(yǎng)基中的愈傷組織緊密，較硬；處理4處理中愈傷組織褐化，堅(jiān)硬；處理5培養(yǎng)基呈淡綠色疏松，說(shuō)明NAA和2，4-D對(duì)花生愈傷組織的誘導(dǎo)效果較單一，同時(shí)添加NAA和2，4-D效果較好。

表1不同激素濃度對(duì)花生愈傷組織誘導(dǎo)的影響

Table1 Effects of different hormone concentration on induction of the peanut callus

處理Treatment外植體數(shù)/個(gè)Numbersof explant誘導(dǎo)率Inductionrate/%愈傷組織形態(tài)Callus morphology14060愈傷組織松散,透明24073愈傷組織半透明,基部已經(jīng)褐化變黑33571愈傷組織緊密,較硬44076愈傷組織褐化,堅(jiān)硬54081愈傷組織淡綠色,疏松

2.2 花生愈傷組織的分化

愈傷組織轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基，經(jīng)過(guò)15 d后，愈傷組織開(kāi)始變綠，30 d后愈傷組織增多，綠色加深，表面變粗，長(zhǎng)出許多小突起，最初為一小綠點(diǎn)進(jìn)而長(zhǎng)成小芽點(diǎn)，再生長(zhǎng)成芽，有單芽，也有叢生芽，有的芽多達(dá)5個(gè)以上，70 d后，大部分的小植株出現(xiàn)一對(duì)復(fù)葉，主莖也開(kāi)始伸長(zhǎng)，也有個(gè)別只生根，沒(méi)長(zhǎng)芽。從表2可見(jiàn)，愈傷組織的誘導(dǎo)不隨著6-BA和NAA的質(zhì)量濃度的提高而提高，較低濃度的6-BA、NAA有利于愈傷組織的分化[7]。

表2不同激素配比對(duì)花生愈傷組織分化的影響

Table2 Effects of different hormone combinations on differentiation of the peanut callus

處理Treatment接種愈傷組織質(zhì)量Weight of inoculatecallus /g分化芽數(shù)Numbers ofdifferentiated bud/個(gè)分化率Differentiationrate/%1234565050505050501598687301816121614

2.3 生根培養(yǎng)基對(duì)根的誘導(dǎo)

經(jīng)誘導(dǎo)的無(wú)根苗，去黃葉和基部后，單棵接入

誘根培養(yǎng)基培養(yǎng)，10 d后，部分外植體切口處有白色根點(diǎn)出現(xiàn)，以處理5較明顯(圖1)。20 d后，部分外植體有較粗的根長(zhǎng)出，40 d后，不同培養(yǎng)基的生根率有顯著差異。從表3可見(jiàn)，低濃度的NAA有利于根的生長(zhǎng)，NAA比IBA效果好[8]。

圖1 培養(yǎng)基上形成的不定芽Fig.1 Adventitious sprouts on medium

處理Treatment接種苗Inoculatedseedling生長(zhǎng)素AuxinIBA/mg·L-1NAA/mg·L-1生根率Rooting rate/%根的形態(tài)Root morpholog130003.3細(xì)小2300.5023.3細(xì)小3301.0033.3細(xì)小4301.5036.7細(xì)小53000.583.3粗壯,側(cè)根多6300163.3粗壯,側(cè)根多73000.563.3粗壯,側(cè)根多

2.4 花生組培苗的移栽

對(duì)已生根的花生組培苗搬到室外進(jìn)行煉苗,其幼苗見(jiàn)圖2。從表4可見(jiàn)，以蛭石∶腐殖土=1∶1基質(zhì)的成活率最高，達(dá)90%。植株成活后大約15 d左右，將組培苗移栽到大田。組培苗室外移栽的最佳時(shí)期是3月份，4月上旬即可移栽田間，讓其有充分的緩苗時(shí)期，不誤農(nóng)季。

圖2 培養(yǎng)基上的再生植株Fig.2 Plant regeneration on medium

Table4 Effects of culture medium on the survival rate of peanut seedlings

處理Treatment 基質(zhì)Matrix 移栽苗/株Transplantedseedling成活率Survivalrate/%1234腐質(zhì)土珍珠巖蛭石蛭石∶腐殖土=1∶15050555071677690

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)采用的花生品種龍花163是由粵油256經(jīng)250GyCo-γ射線(xiàn)照射干種子選育而成的品種，其種仁顆粒大，分泌色素多，種子萌發(fā)時(shí)間相對(duì)長(zhǎng)，污染率高。消毒殺菌時(shí)間過(guò)長(zhǎng)極易影響胚的萌動(dòng)能力，造成發(fā)芽率低，不利于下一步工作的開(kāi)展。

花生愈傷組織的誘導(dǎo)較容易，但愈傷組織的分化較困難，分化率較低，這與前人的試驗(yàn)結(jié)果一致[9，10]。

花生組培苗移栽較困難，經(jīng)過(guò)多種基質(zhì)的反復(fù)試驗(yàn)得出：健壯、高3 cm以上組培苗成活率高，弱小苗成活率低。試管苗在3月份進(jìn)行移栽，用塑料薄膜罩住，以免水分喪失過(guò)快，10 d后揭去塑料薄膜，成活率達(dá)90%。

本試驗(yàn)采用單一的NAA和2，4-D對(duì)花生愈傷組織的誘導(dǎo)效果較差，混合NAA和2，4-D更有利于愈傷組織的分化、不定芽的形成，效果較好。對(duì)已生根的花生組培苗搬到室外進(jìn)行煉苗，以蛭石∶腐殖土=1∶1基質(zhì)的成活率最高，達(dá)90%。

若組培苗定植時(shí)間晚，開(kāi)花生育期較晚，所結(jié)的果莢數(shù)、飽果率、鮮果重、分枝數(shù)等不如直播花生多。

本試驗(yàn)以花生種仁的子葉為外植體獲得了組培苗的高成活率，每個(gè)愈傷組織再生不定芽數(shù)較多，以種子為供試材料，可以不受季節(jié)限制，可為花生遺傳轉(zhuǎn)化、體細(xì)胞雜交及花生種性保持的應(yīng)用提供有效的培養(yǎng)方法。

參 考 文 獻(xiàn)

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