膿毒癥的生物標記物

崔 萍，程寶莉，方向明

膿毒癥是指病原微生物侵入機體的無菌性組織或體腔后所引起的全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，是創(chuàng)傷、燒傷、外科大手術(shù)等臨床急危重患者的嚴重并發(fā)癥之一。

據(jù)報道，美國每年大約有75萬人患膿毒癥［1］，且其發(fā)病率仍在以13．7%/年的速度增加［2］。膿毒癥的死亡率高達35%～65%，是ICU的首要死因，且平均每位患者的醫(yī)療費用約為$22 100［3］。我國的多中心臨床研究表明，外科ICU重癥膿毒癥的發(fā)生率為8．68%，死亡率為48．7%，相當于心肌梗死的死亡率(30%～50%)［4］。盡管近年來新型抗生素應用于臨床及監(jiān)測技術(shù)提高，但人口老齡化、免疫抑制劑使用、侵襲性手術(shù)或嚴重創(chuàng)傷等使膿毒癥的發(fā)病和死亡人數(shù)逐年上升。膿毒癥已成為全球臨床醫(yī)生和研究人員面臨的棘手難題。

生物標記物是用于評價機體正常生物學過程、致病過程或?qū)χ委煾深A的藥物學反應特征的指標。然而，目前研究表明膿毒癥的病理生理過程是一個涉及機體免疫系統(tǒng)、促炎/抗炎系統(tǒng)、凝血/纖溶系統(tǒng)及神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)等多方面的復雜網(wǎng)絡。因此，探尋膿毒癥的早期生物學預警指標成為目前臨床醫(yī)生面臨的重大難題。

本文將關(guān)于膿毒癥生物標記物的一些研究成果進行總結(jié)，希望有助于臨床醫(yī)生或研究人員更好地了解不同種類的生物標記物在膿毒癥的診斷預警、嚴重程度分級、預測預后、指導治療等方面的作用和研究現(xiàn)狀，以便進一步深入探索防治膿毒癥的可行方法。

1 膿毒癥生物標記物的作用及篩選方法

1.1 生物標記物在膿毒癥中的作用

1.1.1 預警 識別可能發(fā)生膿毒癥的高風險患者。研究表明，白介素-10(IL-10)基因的啟動子區(qū)域IL-10-1082基因多態(tài)性與膿毒癥的易感性密切相關(guān)，IL-10-1082G是膿毒癥發(fā)生的高危遺傳標志［5］。

1.1.2 診斷 確定病人是否發(fā)生了膿毒癥，以便及時的實施合理治療。檢測presepsin(sCD14-ST)水平有助于SIRS、膿毒癥、重癥膿毒癥或膿毒癥性休克患者感染的早期鑒別診斷［6］。

1.1.3 危險分級 評判病人是否可以從治療中獲益，繼而指導治療。臨床研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者血漿中pro-ADM濃度較無膿毒癥患者有明顯的升高，并且隨著疾病嚴重程度的加重而相應增加。

1.1.4 療效評估 監(jiān)測患者對治療的反應，從而對治療劑量或療程進行調(diào)節(jié)。新近臨床研究發(fā)現(xiàn)血漿降印鈣素原(PCT)水平的監(jiān)測可用于指導抗生素的應用［7］。

1.2 膿毒癥潛在生物標記物的篩選方法

1.2.1 基于膿毒癥的病理生理機制，篩選出可能與疾病狀態(tài)和治療方案有生物學上的確定聯(lián)系的生物標記物，如sTREM-1是炎癥反應信號的增強因子，機體處于過度炎癥狀態(tài)時，其水平升高。新近臨床研究表明，膿毒癥患者體內(nèi)TREM-1水平與其單核細胞凋亡的程度呈負相關(guān)［8］。在膿毒癥早期，回輸高表達TREM-2的髓系細胞能明顯改善膿毒癥小鼠的預后，減輕重要臟器的損害，減少膿毒癥小鼠局部和全身的細菌負荷量［9］。

1.2.2 利用高通量的基因組學和蛋白組學等方法篩選膿毒癥生物標記物，如Ramilo等［10］利用基因表達譜來區(qū)分住院發(fā)熱患兒是細菌性感染還是病毒性感染。

1.2.3 一些生物標記物可能在膿毒癥患者體內(nèi)檢出有異常表達，但與膿毒癥的病理生理過程關(guān)聯(lián)性不強，如降鈣素原(PCT)水平在感染患者中明顯增高，在感染消除后或使用足量抗生素后PCT水平下降。

目前，被人們提出或應用于膿毒癥防治學的生物標記分子已超過100種，但這些分子是否真正在膿毒癥的診療過程中有效以及如何驗證其有效性還需要進一步的探索研究。

2 現(xiàn)有的膿毒癥生物標記物

膿毒癥的病理生理過程是一個涉及機體免疫系統(tǒng)、促炎/抗炎系統(tǒng)、凝血/纖溶系統(tǒng)及神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)等多個方面的復雜的網(wǎng)絡。目前，膿毒癥的生物標記物是基于其病理生理過程發(fā)現(xiàn)的，主要包括以下7類。

2.1 急性期蛋白生物標記物

2.1.1 C反應蛋白(CRP)主要由肝臟合成，生理狀態(tài)下，體內(nèi)合成CRP速率及血清含量低。膿毒癥時，受IL-6等細胞因子刺激，CRP合成速率迅速增加并大量釋放入血，其血漿濃度可達正常值的20～50倍。目前認為CRP可用于評估感染或膿毒癥的發(fā)生發(fā)展，也可作為診斷性試驗的參數(shù)之一［11］。大量研究顯示，重癥患者血漿CRP濃度與其器官衰竭和(或)死亡風險呈正相關(guān)［12-13］。然而，血漿CRP水平并不能區(qū)分伴有或如心肌梗死、外科手術(shù)等不伴有感染的全身炎癥反應［14］。因此，盡管目前CRP廣泛應用于臨床實踐，但它作為膿毒癥的一個生物標記物缺乏特異性。

2.1.2 降鈣素原(PCT)是降鈣素的前體物質(zhì)，機體在受到內(nèi)毒素或由細菌感染誘導產(chǎn)生的介質(zhì)如IL-1、TNF-α等刺激時釋放大量PCT，嚴重全身感染者PCT水平可在24h內(nèi)升高1000倍。PCT于1993年作為膿毒癥和感染的潛在生物標記物首次被提出，但其生物學作用尚未闡明。與其他膿毒癥生物標記物相比，PCT可以區(qū)分感染或非感染因素引起的全身炎癥反應綜合征，以及細菌或病毒感染［15］。目前PCT已成為診斷膿毒癥和監(jiān)測危重病人的常用生物指標。新近研究表明，PCT或許可用于指導抗生素治療，以避免抗生素濫用，防止多重耐藥菌產(chǎn)生，降低醫(yī)療費用等［7，16］。此外，2012年P(guān)CT作為診斷膿毒癥的輔助生物標記物被納入了國際嚴重膿毒癥和膿毒性休克治療指南［17］。

2.2 細胞因子/趨化因子類生物標記物

白介素-6(IL-6):是一種多效細胞因子，主要參與機體炎癥反應、細胞免疫、造血調(diào)控等過程。TNF-α等可誘導單核細胞、B/T細胞等多種有核細胞合成IL-6。IL-6信號通路調(diào)節(jié)異?？蓪е掳摱景Y在內(nèi)的一些炎癥相關(guān)性疾病。研究顯示，血漿IL-6水平在膿毒癥患者中顯著增高，增高幅度與膿毒癥的嚴重程度和不良預后呈正相關(guān)［18-19］，且可作為診斷新生兒膿毒癥的生物標記物［20］。IL-6基因啟動子區(qū)域存在多個SNPs，包括-174G/C、-1753C/G、-2954G/C等。研究表明，具有-174C/1753C/2954G(C/C/G)、G/G/G或G/C/C單倍型的SIRS重癥患者發(fā)生死亡率和多器官衰竭的風險增加。針對我國漢族人群的研究表明，IL-6基因啟動子-572位點C-G的突變可降低IL-6基因的轉(zhuǎn)錄活性，其多態(tài)性或許可作為一個評估嚴重創(chuàng)傷演變?yōu)槟摱景Y相關(guān)風險性的生物標記物［21］。因此，IL-6的基因多態(tài)性有望成為膿毒癥的高危遺傳標記物。

2.3 細胞標記類生物標記物

可溶性單核細胞人白血病抗原-DR(mHLA-DR):屬于主要組織相容性復合物(MHC)II類抗原，是表達在抗原呈遞細胞上的糖基化細胞表面膜蛋白。研究表明，mHLA-DR可作為判斷膿毒癥患者疾病狀態(tài)的生物標記物，繼而指導臨床免疫治療的應用。而且，監(jiān)測mHLA-DR水平的變化有助于識別高風險的繼發(fā)感染。臨床研究顯示，以mHLA-DR為指導，對重癥膿毒癥患者進行GMCSF免疫增強治療是安全有效的，且可縮短機械通氣和醫(yī)院/ICU住院時間［22］。因此，mHLA-DR或許可成為判定膿毒癥病理狀態(tài)和指導膿毒癥病人免疫治療的生物學指標。

2.4 受體類生物標記物

2.4.1 Toll樣受體-4(TLR-4)是TLR家族中的重要成員，表達在巨噬細胞、內(nèi)皮細胞等細胞表面的跨膜蛋白，主要識別革蘭氏陰性細菌的脂多糖成分。資料顯示，TLR-4基因+896 A/G(即Asp299Gly)和1196 C/T(即Thr399Ile)的多態(tài)性與對入侵LPS的低反應性及燒傷后演變?yōu)橹匕Y膿毒癥的風險顯著相關(guān)，即TLR-4基因的遺傳變異增加了個體膿毒癥的易感性，且TLR4基因896A/G是重癥膿毒癥的獨立危險因素。因此，TLR-4基因多態(tài)性有可能成為預測膿毒癥患者預后的有效生物標記物。

2.4.2 髓系細胞表達的觸發(fā)受體(TREM-1)是表達在中性粒細胞、單核巨噬細胞等細胞表面的TREM蛋白家族成員，可協(xié)同增強TLRs和NLRs識別PAMPs和DAMPs后活化的炎癥信號通路［23］。研究表明，在肺炎、胰腺炎和腹膜炎等局部疑似感染的部位進行sTREM-1表達水平的評估顯示出了較好的診斷效果［24］。檢測尿液中sTREM-1水平在早期診斷、動態(tài)評估膿毒癥嚴重程度以及預測預后等方面，是一種具有比WBC、CRP和PCT更高敏感性和特異性的非侵入性檢查。然而，由于檢測方法敏感性的不同或研究對象的差異等原因，針對sTREM-1的研究出現(xiàn)了不一致的研究結(jié)果［25］。因此，sTREM-1在膿毒癥診斷中的應用價值仍有待更多更大樣本的臨床試驗證實。

2.5 凝血類生物標記物

蛋白C:蛋白C通路是機體的天然抗凝系統(tǒng)之一，而蛋白C是其中的重要分子。活化的蛋白(APC)具有使凝血因子Va和VIIIa失活、抑制纖溶酶原活化抑制劑、減輕粒細胞的黏附和凋亡以及減少細胞因子產(chǎn)生的作用，故在重癥膿毒癥的發(fā)病機制中也起著重要作用。新近研究表明，APC受體EPCR(endothelial protein C receptor)的基因多態(tài)性可能與膿毒癥的嚴重程度相關(guān)，即攜帶EPCR基因T6333C和A6936G單倍型的重癥患者演變?yōu)橹匕Y膿毒癥或膿毒癥休克的風險較低［26］。研究表明，蛋白C水平與重癥膿毒癥患者器官功能衰竭及死亡風險呈負相關(guān)［27］，且應用重組人活化蛋白C治療可顯著降低重癥膿毒癥的死亡率。因此，蛋白C或許可作為指導臨床應用rhAPC治療膿毒癥和改善膿毒癥預后的生物標記物，其基因多態(tài)性或許有望成為評估膿毒癥嚴重程度的遺傳生物標記物。

2.6 器官功能障礙類生物標記物

利尿鈉肽(Natriuretic peptides):包括心房利尿鈉肽(ANP)、腦利尿鈉肽(BNP)和C型利尿鈉肽(CNP)3種，是一類具有強烈利尿、利鈉、擴血管及降低血壓等作用的多肽類激素。研究表明，血漿心房鈉尿肽前體中肽段(MR-proANP)的水平與膿毒癥的嚴重程度呈正相關(guān)，也是呼吸機相關(guān)性肺炎死亡率的獨立影響因子。N-端腦鈉肽前體(NT-proBNP)可作為一個預測重癥膿毒癥死亡率的獨立生物標記物。若患者BNP水平超過49 pg/ml，則具有高死亡及向重癥膿毒癥或膿毒癥休克進展的高風險［14］。有資料顯示，膿毒癥患者體內(nèi)CNP水平升高，是預測創(chuàng)傷病人發(fā)生膿毒癥的生物標記物［28］。近期研究表明，N-末端C型利鈉肽原(NT-proCNP)水平在危重癥病人中顯著升高，膿毒癥病人中最高，且機體的炎癥反應和器官衰竭程度與血漿NT-proCNP水平密切相關(guān)［29］。然而，利尿鈉肽對于膿毒癥在臨床上的應用價值及其敏感性和特異性需進一步的研究驗證。

2.7 其他生物標記物

游離DNA(cfDNA):是一種存在于體液中的細胞外游離狀態(tài)的核苷酸，主要由肝臟代謝。血漿內(nèi)cfDNA過量積聚可能是由于大量細胞死亡或(和)死細胞清除效率低下導致，但其在膿毒癥患者中的精確機制尚未知。臨床研究表明，cfDNA和核小體水平在預后較差的膿毒癥患者體內(nèi)顯著升高，是預測重癥患者感染和ICU住院死亡率的獨立生物標記物［30-31］。近期研究表明，與MODS評分、APACHEII評分或其他生物標記物的檢測相比，血漿cfDNA具有更高的預測精確度。數(shù)據(jù)顯示，將cfDNA與蛋白C及MODS評分聯(lián)合應用或許會有更好的預測效能，或者將cfDNA納入膿毒癥危險分級系統(tǒng)(如PIRO分級系統(tǒng))中或許有助于臨床決策的制定［32］。

3 展望

盡管研究者們已針對上述如此多的生物標記物開展了大量的研究，但目前還沒有一種敏感性和特異性良好的生物標記能夠常規(guī)用于臨床。以往多認為膿毒癥的發(fā)生發(fā)展是由過度的炎癥反應所致。然而，隨著對膿毒癥病理生理研究的逐步深入，新近觀點認為，膿毒癥的病理生理過程包括早期機體的過度炎癥反應和隨后的免疫抑制狀態(tài)。臨床研究觀察到膿毒癥死亡者主要臟器淋巴細胞數(shù)目明顯減少，免疫抑制性細胞MDSC等的數(shù)目明顯增多［33-34］。因此，單純基于促炎反應的生物標記物研究的科學性似乎有待商榷，探尋識別免疫抑制與否的細胞或相應分子標記對膿毒癥的預警診治則更為重要。此外，膿毒癥作為一種環(huán)境因素和遺傳因素交互作用的復雜性疾病，PIRO分級系統(tǒng)中表觀遺傳標記、單核苷酸變異和基因拷貝等也將是膿毒癥生物標記物研究的重要領(lǐng)域。

［1］Lever A，Mackenzie I．Sepsis:definition，epidemiology，and diagnosis［J］．BMJ，2007，335(7625):879-883．

［2］Martin GS，Mannino DM，Eaton S，et al．The epidemiology of sepsis in the United States from 1979 through 2000［J］．N Engl J Med，2003，348(16):1546-1554．

［3］Angus DC，Linde-Zwirble WT，Lidicker J，et al．Epidemiology of severe sepsis in the United States:analysis of incidence，outcome，and associated costs of care［J］．Crit Care Med，2001，29(7):1303-1310．

［4］Cheng B，Xie G，Yao S，et al．Epidemiology of severe sepsis in critically ill surgical patients in ten university hospitals in China［J］．Crit Care Med，2007，35(11):2538-2546．

［5］方向明，舒強，唐明山，等．白介素10基因多態(tài)性與術(shù)后膿毒癥發(fā)生發(fā)展的相關(guān)研究［J］．中國危重病急救醫(yī)學，2001，13(5):265-268．

［6］Ulla M，Pizzolato E，Lucchiari M，et al．Diagnostic and prognostic value of presepsin in the management of sepsis in the emergency department:a multicenter prospective study［J］．Crit Care，2013，17(4):R168．

［7］Heyland DK，Johnson AP，Reynolds SC，et al．Procalcitonin for reduced antibiotic exposure in the critical care setting:a systematic review and an economic evaluation［J］．Crit Care Med，2011，39(7):1792-1799．

［8］Cai M，Chen Q，Chen C，et al．Activation of triggering receptor expressed on myeloid cells-1 protects monocyte from apoptosis through regulation of myeloid cell leukemia-1［J］．Anesthesiology，2013，118(5):1140-1149．

［9］Chen Q，Zhang K，Jin Y，et al．Triggering receptor expressed on myeloid cells-2 protects against polymicrobial sepsis by enhancing bacterial clearance［J］．Am JRespir Crit Care Med，2013，188(2):201-212．

［10］Ramilo O，Allman W，Chung W，et al．Gene expression patterns in blood leukocytes discriminate patients with acute infections［J］．Blood，2007，109(5):2066-2077．

［11］Reinhart K，Bauer M，Riedemann NC，et al．New approaches to sepsis:molecular diagnostics and biomarkers［J］．Clin Microbiol Rev，2012，25(4):609-634．

［12］Lobo SM，Lobo FR，Bota DP，et al．C-reactive protein levels correlate with mortality and organ failure in critically ill patients［J］．Chest，2003，123(6):2043-2049．

［13］Ozsu S，Yilmaz G，Yilmaz I，et al．C-reactive protein alone or combined with cardiac troponin Tfor risk stratification of respiratory intensive care unit patients［J］．Respir Care，2011，56(7):1002-1008．

［14］Lichtenstern C，Brenner T，Bardenheuer HJ，et al．Predictors of survival in sepsis:what is the best inflammatory marker to measure［J］．Curr Opin Infect Dis，2012，25(3):328-336．

［15］Cuquemelle E，Soulis F，Villers D，et al．Can procalcitonin help identify associated bacterial infection in patients with severe influenza pneumonia:a multicentre study［J］．Intensive Care Med，2011，37(5):796-800．

［16］Bouadma L，Luyt C E，Tubach F，et al．Use of procalcitonin to reduce patients'exposure to antibiotics in intensive care units(PRORATA trial):a multicentre randomised controlled trial［J］．Lancet，2010，375(9713):463-474．

［17］Dellinger RP，Levy MM，Rhodes A，et al．Surviving sepsis campaign:international guidelines for management of severe sepsis and septic shock:2012［J］．Crit Care Med，2013，41(2):580-637．

［18］Barkhausen T，Tschernig T，Rosenstiel P，et al．Selective blockade of interleukin-6 trans-signaling improves survival in a murine polymicrobial sepsis model［J］．Crit Care Med，2011，39(6):1407-1413．

［19］Yende S，D'Angelo G，Kellum JA，et al．Inflammatory markers at hospital discharge predict subsequent mortality after pneumonia and sepsis［J］．Am JRespir Crit Care Med，2008，177(11):1242-1247．

［20］Shahkar L，Keshtkar A，Mirfazeli A，et al．The role of IL-6 for predicting neonatal sepsis:a systematic review and meta-analysis［J］．Iran JPediatr，2011，21(4):411-417．

［21］Gu W，Du DY，Huang J，et al．Identification of interleukin-6 promoter polymorphisms in the Chinese Han population and their functional significance［J］．Crit Care Med，2008，36(5):1437-1443．

［22］Meisel C，Schefold JC，Pschowski R，et al．Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor to reverse sepsis-associated immunosuppression:a double-blind，randomized，placebo-controlled multicenter trial［J］．Am J Respir Crit Care Med，2009，180(7):640-648．

［23］Gomez-Pina V，Soares-Schanoski A，Rodriguez-Rojas A，et al．Metalloproteinases shed TREM-1 ectodomain from lipopolysaccharidestimulated human monocytes［J］．J Immunol，2007，179(6):4065-4073．

［24］Derive M，Gibot S．Urine sTREM-1 assessment in diagnosing sepsis and sepsis-related acute kidney injury［J］．Crit Care，2011，15(6):1013．

［25］Palmiere C，Bardy D，Mangin P，et al．Value of sTREM-1，procalcitonin and CRP as laboratory parameters for postmortem diagnosis of sepsis［J］．J Infect，2013，67(6):545-555．

［26］Vassiliou AG，Maniatis NA，Kotanidou A，et al．Endothelial protein C receptor polymorphisms and risk of severe sepsis in critically ill patients［J］．Intensive Care Med，2013，39(10):1752-1759．

［27］Favory R，Poissy J，Alves I，et al．Activated protein Cimproves macrovascular and microvascular reactivity in human severe sepsis and septic shock［J］．Shock，2013，40(6):512-518．

［28］Bahrami S，Pelinka L，Khadem A，et al．Circulating NT-proCNP predicts sepsis in multiple-traumatized patients without traumatic brain injury［J］．Crit Care Med，2010，38(1):161-166．

［29］Koch A，Voigt S，Sanson E，et al．Prognostic value of circulating amino-terminal pro-C-type natriuretic peptide in critically ill patients［J］．Crit Care，2011，15(1):R45．

［30］Huttunen R，Kuparinen T，Jylhava J，et al．Fatal outcome in bacteremia is characterized by high plasma cell free DNA concentration and apoptotic DNA fragmentation:a prospective cohort study［J］．PLoSOne，2011，6(7):e21700．

［31］Saukkonen K，Lakkisto P，Pettila V，et al．Cell-free plasma DNA as a predictor of outcome in severe sepsis and septic shock［J］．Clin Chem，2008，54(6):1000-1007．

［32］Dwivedi DJ，Toltl LJ，Swystun LL，et al．Prognostic utility and characterization of cell-free DNA in patients with severe sepsis［J］．Crit Care，2012，16(4):R151．

［33］Hotchkiss RS，Monneret G，Payen D．Immunosuppression in sepsis:a novel understanding of the disorder and a new therapeutic approach［J］．Lancet Infect Dis，2013，13(3):260-268．

［34］Hotchkiss RS，Monneret G，Payen D．Sepsis-induced immunosuppression:from cellular dysfunctions to immunotherapy［J］．Nat Rev Immunol，2013，13(12):862-874．