雙鏈寡聚脫氧核苷酸/載體復(fù)合物在急性肺損傷肺泡巨噬細(xì)胞中的體外轉(zhuǎn)染效率研究

尹 文，王倩梅，馮 洋，朱金文，李明月，高 路

失血性休克(hemorrhagic shock，HS)是一種臨床常見病癥，常引發(fā)急性肺損傷(acute lung injury，ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，后期出現(xiàn)多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)［1］。其中，ALI、ARDS和MODS的共同發(fā)病基礎(chǔ)是失控性全身炎癥反應(yīng)［2］，因此近年來防治ALI/ARDS的焦點(diǎn)轉(zhuǎn)向炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控的領(lǐng)域，成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)研究方向［3］。核因子-кB(NF-кB)是一種多向性的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，參與多種炎癥介質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控，其激活效應(yīng)在ALI/ARDS/MODS的序貫病理損害過程中發(fā)揮著重要作用［4-7］。本實(shí)驗(yàn)主要在NF-кB識別靶基因кB序列的關(guān)鍵環(huán)節(jié)上采取特異性措施干預(yù)，抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，觀察NF-кB圈套dsODNs載體復(fù)合物對肺泡巨噬細(xì)胞體外轉(zhuǎn)染效率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為臨床篩選特異性藥物、阻斷全身性炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)炎癥瀑布效應(yīng)，防治ALI/ARDS提供新的靶點(diǎn)。

材料與方法

1 材料

健康家兔，體重1．8～2．3kg，雌雄不限，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。本實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)動物的處置方法符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

戊巴比妥鈉購于Gibco公司，LPS、Lipofectamine2000購于Sigma公司，兔LDH試劑盒購于上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司，NF-кB ODN購于上海生工生物工程公司。

CK-40型倒置生物顯微鏡、BX51型正置熒光顯微鏡、FV1000激光共聚焦顯微鏡購于日本Olympus公司，流式細(xì)胞儀購于XXXX1-BD FACSCaibur公司。

2 方法

2.1 失血性休克動物模型建立，提取肺泡巨噬細(xì)胞(AM)實(shí)驗(yàn)家兔以3%戊巴比妥鈉(40mg/kg)耳緣靜脈注射麻醉后，固定于恒溫手術(shù)臺。分離其右側(cè)股動、靜脈，插管后連接于多道生理記錄儀，檢測并記錄其平均動脈壓?？焖俜叛?，使家兔平均動脈壓在15min內(nèi)降至30～40mmHg，通過回輸血液(回輸時(shí)間＞30min)維持該水平60min。待血壓平穩(wěn)后，經(jīng)股動脈采血，行血?dú)夥治龃_定失血性休克致急性肺損傷動物模型建立成功［8］。氣管切開做一插管，行支氣管肺泡灌洗后，提取灌洗液，低速離心提取AM。

2.2 AM鑒定及傳代 待巨噬細(xì)胞貼壁90%后，取出培養(yǎng)瓶，傾倒瓶內(nèi)陳舊的培養(yǎng)液，用Hanks液清洗1次以消除小牛血清對胰酶活性的抑制。加入37℃的0．25%胰酶溶液，覆蓋貼壁細(xì)胞，消化3min左右，使細(xì)胞游離后終止消化，加入2ml含1%雙抗、100ml/L小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，用吸管吹打平皿底部幾次，使貼壁細(xì)胞充分脫落。以70%乙醇和清水依次清洗細(xì)胞計(jì)數(shù)板及其蓋玻片;將細(xì)胞稀釋成均勻的懸液，用毛細(xì)滴管在蓋玻片下方滴加一滴細(xì)胞懸液，使之充盈計(jì)數(shù)室;在顯微鏡下，用10×物鏡觀察計(jì)數(shù)板四角大方格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞濃度和總細(xì)胞數(shù)。用消化液調(diào)節(jié)AM濃度至5×109個(gè)/ml，行瑞士染色(美藍(lán)-伊紅染色)，經(jīng)鏡檢胞漿紅色，胞核藍(lán)色者為巨噬細(xì)胞;將濃度調(diào)節(jié)至1×106細(xì)胞/ml，制備單細(xì)胞懸液;行臺盼藍(lán)染色，正常細(xì)胞不著色，死亡細(xì)胞呈淡藍(lán)色，3min內(nèi)計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞并計(jì)算活細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，細(xì)胞活力(%)=(總細(xì)胞數(shù)-著色細(xì)胞數(shù))÷總細(xì)胞數(shù)×100%，確保細(xì)胞活力﹥95%。行AM傳代培養(yǎng)。

2.3 AM分組轉(zhuǎn)染及LDH活性檢測 分組轉(zhuǎn)染干預(yù)(n=10;每個(gè)處理組分別選取2組細(xì)胞，各設(shè)5個(gè)復(fù)孔):(1)對照組:AM經(jīng)提純并傳代后，不加任何干預(yù)，培養(yǎng)4、6、8h時(shí)分別檢測其LDH含量;(2)LPS刺激組:AM經(jīng)提純并傳代后，給予10μg/ml LPS，余同對照組;(3)Lipofectamine2000組(Lipo2000組):AM經(jīng)提純并傳代后，先后給予10μg/ml LPS和Lipofectamine2000，余 同 對 照 組;(4)NF-κB dsODNs/Lipofectamine2000組(dsODNs組):AM經(jīng)提純并傳代后，先給予10μg/ml LPS，再給予預(yù)先配置 好 的 不 同 濃 度 的 NF-κB dsODNs/Lipofectamine2000(1∶0、1∶1、1∶3、1∶5、1∶7、1∶9)，余同對照組。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)相對熒光強(qiáng)度和細(xì)胞攝取率;激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞爬片中的綠色熒光分布。

其中，寡聚脫氧核苷酸(ODN)由上海生工生物工程公司合成，均經(jīng)全硫代修飾，并在5'端標(biāo)記異硫氰酸熒光素(FITC)(激發(fā)光:488nm;發(fā)射光525nm。)序列如下:

ODN退火采用等摩爾互補(bǔ)單鏈ODN混合，98℃水浴5min，然后緩慢降至室溫，形成雙鏈脫氧核苷酸(dsODNs)，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)相對熒光強(qiáng)度和細(xì)胞攝取率 分別取NF-κB dsODNs/Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染處理4、6h和8h時(shí)的AM細(xì)胞懸液，將濃度調(diào)整至1×106細(xì)胞/ml，以4%多聚甲醛固定，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗后，每份標(biāo)本收集10 000個(gè)細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)相對熒光強(qiáng)度和細(xì)胞攝取率。根據(jù)活細(xì)胞數(shù)用Cell QuestTM軟件處理數(shù)據(jù)，評價(jià)轉(zhuǎn)染效率。

2.5 激光共聚焦顯微鏡觀察熒光分布 取dsODNs組的AM細(xì)胞懸液，行細(xì)胞爬片。待細(xì)胞貼壁，分裂生長密度達(dá)40%左右時(shí)為爬片標(biāo)本制作成功。樣本完成后于激光共聚焦顯微鏡下觀察、照相并記錄。2.6 統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，用SPSS17．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)方法采用等距重復(fù)測量方差分析、單因素方差分析等。

結(jié) 果

1 不同培養(yǎng)時(shí)間與細(xì)胞毒性的關(guān)系

如表1所示，對照組LDH水平隨培養(yǎng)時(shí)間增長無明顯變化趨勢。而LPS組、Lipo2000組和dsODNs組的LDH水平隨時(shí)間增長明顯升高，均在8h時(shí)水平最高(圖1)，即細(xì)胞毒性最強(qiáng);且在培養(yǎng)4、6h和8h時(shí)均高于對照組。另一方面，dsODNs組的LDH水平在各培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)均明顯低于Lipo2000組(P＜0．01)和LPS組(P＜0．01)。該結(jié)果提示NF-κB dsODNs/Lipofectamine2000能夠有效減輕細(xì)胞損傷，降低細(xì)胞毒性。

2 不同dsODNs/Lipofectamine2000濃度比率與細(xì)胞毒性的關(guān)系

表1提示培養(yǎng)6h時(shí)細(xì)胞毒性適中，因此以下實(shí)驗(yàn)均選取6h為例研究，實(shí)驗(yàn)觀察不同比率的(dsODNs:Lipofectamine2000)轉(zhuǎn)染組中LDH值變化，結(jié)果表明隨著Lipofectamine2000比率的增加，細(xì)胞LDH含量逐漸增加，但在1∶5時(shí)出現(xiàn)折點(diǎn)(圖1)。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)dsODNs/Lipofectamine2000濃度比率為1∶5時(shí)產(chǎn)生的LDH與其他比率各組(除1∶3組外)相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。該結(jié)果提示NF-кB圈套dsODNs與Llipofectamine2000在一定濃度比率范圍內(nèi)影響細(xì)胞損傷程度，而1∶5為可供選擇的合適轉(zhuǎn)染濃度。

3 轉(zhuǎn)染效率的評估

不同dsODNs/Lipofectamine2000濃度比率對轉(zhuǎn)染效率的影響如表2所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示在轉(zhuǎn)染6h時(shí)，dsODNs/Lipofectamine2000各濃度比率組的平均熒光強(qiáng)度均較無Lipo2000組(1∶0)明顯增高，其中以1∶5組(P＜0．01)最高，細(xì)胞攝取率也以1∶5組(P＜0．01)最高，均顯著高于1∶0組。該結(jié)果提示轉(zhuǎn)染效率與脂質(zhì)體的濃度之間不呈正比關(guān)系，即單純增加Lipofectamine2000并不能有效提高轉(zhuǎn)染效率。表2的結(jié)果還提示，各濃度比率組LDH含量隨Lipofectamine2000比率的增加呈現(xiàn)增加的趨勢。綜上所述，表2的結(jié)果表明，在dsODNs/Lipofectamine2000濃度比率為1∶5、轉(zhuǎn)染時(shí)間6h時(shí)，轉(zhuǎn)染效率最高，而細(xì)胞毒性適中。

4 NF-кB圈套dsODNs在細(xì)胞內(nèi)的分布

如圖2所示，在熒光顯微鏡可見光下觀察發(fā)現(xiàn)無Lipo2000組(濃度1∶0)以及dsODNs/Lipofecetamine2000 1∶1、1∶3、1∶5組細(xì)胞形態(tài)無明顯變化;1∶7、1∶9組可見肺泡巨噬細(xì)胞變圓，突觸減少;1∶9組有一定數(shù)量的細(xì)胞死亡，出現(xiàn)漂浮現(xiàn)象。Lipofectamine2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染各組熒光物質(zhì)分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，其中以dsODNs/Lipofectamine2000為1∶5時(shí)熒光最強(qiáng)，1∶0即無Lipofectamine2000、直接轉(zhuǎn)染組細(xì)胞核內(nèi)少見熒光。

dsODNs/Lipofectamine2000比率為1∶5時(shí)，不同時(shí)間點(diǎn)(4、6h和8h)的熒光強(qiáng)度檢測結(jié)果提示6h時(shí)熒光強(qiáng)度最大(圖3)。

圖1 不同dsODNs/Lipofectamine2000濃度比率對LDH產(chǎn)生的影響

表1 培養(yǎng)時(shí)間對LDH產(chǎn)生的影響(U/L，±s)

表1 培養(yǎng)時(shí)間對LDH產(chǎn)生的影響(U/L，±s)

與Lipo2000組比較:*P＜0．01;與LPS組比較:#P＜0．01

?

表2 dsODNs/Lipofectamine2000不同濃度比率對LDH產(chǎn)生量、熒光強(qiáng)度和細(xì)胞攝取率的影響

圖2 不同dsODNs/Lipofecetamine2000轉(zhuǎn)染，6h時(shí)肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)攝取FITC標(biāo)記的NF-кB decoy dsODNs。a．dsODNs/Lipofecetamine2000 1∶0;b．dsODNs/Lipofecetamine2000 1∶1;c．dsODNs/Lipofecetamine2000 1∶3;d．dsODNs/Lipofecetamine2000 1∶5;e．dsODNs/Lipofecetamine2000 1∶7;f．dsODNs/Lipofecetamine2000 1∶9

圖3 dsODNs/Lipofecetamine2000比率為1∶5時(shí)不同轉(zhuǎn)染時(shí)間肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)攝取FITC標(biāo)記的NF-кB decoy dsODNs。a．4h;b．6h;c．8h

討 論

NF-кB是一種廣泛存在于多種細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，在靜息狀態(tài)下，通常以無活性的形式存在于胞漿。創(chuàng)傷、休克、內(nèi)毒素等多種胞外刺激能夠啟動細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑使其活化，調(diào)控TNF-α等細(xì)胞因子、黏附分子和炎癥相關(guān)的酶及蛋白質(zhì)的表達(dá)，介導(dǎo)SIRS誘發(fā)的臟器損傷。NF-кB是多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的匯聚點(diǎn)，是調(diào)控炎癥細(xì)胞因子基因表達(dá)的瓶頸［9］。如果在NF-кB識別靶基因的кB序列的關(guān)鍵環(huán)節(jié)上采取特異性措施來干預(yù)、抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，勢必能為我們篩選特異性藥物、阻斷SIRS炎癥瀑布效應(yīng)防治SIRS/ALI找到新的突破口。

NF-кB圈套dsODNs［10］作為一種新型的基因治療手段，合成與кB序列相一致的雙鏈寡聚脫氧核苷酸(dsODNs)，通過載體轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，可以競爭性抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-кB與順式元件кB序列的結(jié)合，占有NF-кB的DNA結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活化的NF-кB不能結(jié)合到靶基因的啟動子區(qū)域，從而干擾轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性及其后續(xù)基因的表達(dá)。這種方法在腫瘤、器官移植等疾病的基因治療中已經(jīng)應(yīng)用。但是這需要依賴一個(gè)有效的方法提高靶細(xì)胞對NF-кB圈套dsODNs的攝取，減少細(xì)胞內(nèi)核酸酶對其的降解作用。

經(jīng)過大量研究證實(shí)，脂質(zhì)體(LPS)介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法［4］是轉(zhuǎn)染寡聚脫氧核苷酸理化方法中的最佳選擇之一。陽離子脂質(zhì)體是一種高效的核酸物質(zhì)轉(zhuǎn)染載體，其表面的正電荷可與核酸的磷酸根通過靜電作用將DNA分子包裹入內(nèi)，形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物，也能被表面帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜吸附，再通過細(xì)胞膜的融合或細(xì)胞內(nèi)吞作用將DNA導(dǎo)入細(xì)胞，并且可以保護(hù)基因不被核酸酶降解。脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，形成內(nèi)涵體，內(nèi)涵體膜破壞并釋放DNA;最后DNA進(jìn)入細(xì)胞核并在相應(yīng)位點(diǎn)整合，使轉(zhuǎn)染基因得以表達(dá)。影響脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的主要因素有細(xì)胞類型、細(xì)胞密度、細(xì)胞狀態(tài)、脂質(zhì)體組成、脂質(zhì)體粒徑大小、質(zhì)粒DNA純度、DNA與脂質(zhì)體的比率、制備脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物所用緩沖液、轉(zhuǎn)染的溫度和時(shí)間等，其中DNA與脂質(zhì)體的比率是決定性的影響因素。陽離子脂質(zhì)體在基因治療方面已經(jīng)取得了喜人的成果，但仍存在一定的局限性，如對器官的靶向性不明顯，基因轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制不明確等。另外，也因?yàn)槠渲|(zhì)的特性和表面帶有大量的正電荷，會對細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒性。對細(xì)胞毒性增強(qiáng)會影響轉(zhuǎn)染效率。LDH正常情況下存在于細(xì)胞漿內(nèi)，只有當(dāng)細(xì)胞受損細(xì)胞膜破裂或者細(xì)胞死亡裂解時(shí)才通過損傷的細(xì)胞膜泄漏到細(xì)胞外。體外培養(yǎng)時(shí)進(jìn)入到細(xì)胞基質(zhì)中，在體內(nèi)則進(jìn)入血液。因此，通過檢測培養(yǎng)液或血清中的LDH的含量可以間接了解 Lipofectamine2000對細(xì)胞的毒性。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:(1)LPS刺激組更加接近于人體內(nèi)環(huán)境發(fā)生內(nèi)毒素血癥時(shí)AM中NF-κB信號通路啟動、激活的病理過程。AM損傷較對照組嚴(yán)重，LDH水平明顯增高(P＜0．01)，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(2)Lipofectamine2000是帶有大量正電荷的陽離子脂質(zhì)體，具有細(xì)胞毒性，隨著Lipofectamine2000比例的升高或轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長，培養(yǎng)上清液中的LDH含量升高，顯微鏡下培養(yǎng)8h后可觀察到細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞的活力降低，并且部分細(xì)胞死亡，出現(xiàn)漂浮現(xiàn)象，此時(shí)轉(zhuǎn)染的效率也下降。說明細(xì)胞毒性的增加會影響轉(zhuǎn)染的效率。(3)dsODNs/Lipofecetamine2000濃度比率為1∶5，轉(zhuǎn)染時(shí)間6h時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過體外摸索脂質(zhì)體載體Lipofectamine2000與dsODNs的最佳比例和轉(zhuǎn)染時(shí)間，為進(jìn)一步的體內(nèi)試驗(yàn)提供依據(jù)，從而在細(xì)胞分子水平為臨床防治SIRS/ALI篩選精確藥物靶點(diǎn)和尋求高效合理的治療方案提供前瞻性的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］Giangola MD，Yang WL，Rajayer SR，et al．Growth arrestspecific protein 6 attenuates neutrophil migration and acute lung injury in sepsis［J］．Shock，2013，40(6):485-491．

［2］Kang P，Kim KY，Lee HS，et al．Anti-inflammatory effects of anethole in lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice［J］．Life Sci，2013，93(24):955-961．

［3］Li H，Han W，Polosukhin V，et al．NF-κB inhibition after cecal ligation and puncture reduces sepsis:associated lung injury without altering bacterial host defense［J］．Mediators Inflamm，2014．［Epub ahead of print］

［4］Liang XM，Guo GF，Huang XH，et al．Isotetrandrine protects against lipopolysaccharide-induced acute lung injury by suppression of mitogen-activated protein kinase and nuclear factor-kappa B［J］．JSurg Res，2014，187(2):596-604．

［5］Li X，Zhou X，Ye Y，et al．Lyn regulates inflammatory responses in Klebsiella pneumoniae infection via the p38/NF-κB pathway［J］．Eur J Immunol，2014，44(3):763-773．

［6］Wang G，Huang X，Li Y，et al．PARP-1 Inhibitor，DPQ，attenuates LPS-induced acute lung injury through inhibiting NF-κB-mediated inflammatory response［J］．PLoS One，2013，8(11):e79757．

［7］Matsuda A，Yang WL，Jacob A，et al．FK866，a visfatin inhibitor，protects against acute lung injury after intestinal ischemia-reperfusion in mice via NF-κB pathway［J］．Ann Surg，2014，259(5):1007-1017．

［8］陳勇，周繼紅，歐陽瑤．急性肺損傷實(shí)驗(yàn)動物模型［J］．創(chuàng)傷外科雜志，2013，15(5):466-469．

［9］Yu C，Xu L，Chen LF，et al．PRBC-derived plasma induces non-muscle myosin type IIA-mediated neutrophil migration and morphologic change［J］．Immunopharmacol Immunotoxicol，2013，35(1):71-79．

［10］Hu MM，Yang Q，Zhang J，et al．TRIM38 inhibits TNF-α and IL-1β-triggered NF-κB activation by mediating lysosome-dependent degradation of TAB2/3［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2014，111(4):1509-1514．