紅細胞血紅蛋白釋放試驗的臨床研究進展

李嘉欣，蘇 燕

（包頭醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，內(nèi)蒙古包頭014060）

包頭醫(yī)學院血紅蛋白研究室于20世紀80年代初便創(chuàng)建了淀粉-瓊脂糖混合凝膠電泳，主要用來觀察血紅蛋白的電泳行為。試驗時不需要制備紅細胞裂解液，可直接用全血進行電泳觀察，大大提高了研究效率。2007年，本研究組在進行一例輕型β-地中海貧血患者的紅細胞電泳過程中偶然發(fā)現(xiàn)了血紅蛋白（hemoglobin，Hb）再釋放現(xiàn)象，并依此創(chuàng)建了血紅蛋白釋放試驗（hemoglobin releasing test，HRT）［1-3］。紅細胞內(nèi)血紅蛋白釋放試驗是將未裂解的完整紅細胞加在淀粉-瓊脂糖混合凝膠中進行電泳，一次通電完成電泳，此時有Hb釋放出來，稱為“初釋放”；如果在電泳釋放過程中進行“斷電-再通電”，又會有Hb從原點釋放出來，稱為“再釋放”。正常情況下，初釋放時，紅細胞內(nèi)的大部分Hb都釋放出來，殘留較少；再釋放時，殘留Hb再次離開紅細胞，出現(xiàn)新的Hb區(qū)帶［2，4］。試驗過程中，本研究組將這一技術(shù)不斷發(fā)展，并應用于臨床病例的研究，比較了多種疾病及手術(shù)前后血液中紅細胞HRT 結(jié)果的差異，并初步探討了其臨床意義，現(xiàn)對其臨床研究進展做一綜述。

1 紅細胞血紅蛋白電泳再釋放技術(shù)的建立與發(fā)展

根據(jù)電泳過程中停電的次數(shù)分為“單帶再釋放”和“多帶再釋放”。紅細胞“單帶再釋放”是指在電泳過程中人為停電-再通電一次，僅釋放出一個Hb區(qū)帶，由于再釋放Hb條帶的位置可通過設(shè)定再通電的開動時間而定點，因此又稱為“定點單帶再釋放”；“多帶再釋放”是指在電泳過程中人為停電-再通電多次，則釋放出多個Hb區(qū)帶，像梯子一樣，故又稱為“梯帶再釋放”。為了消除不同樣本間上樣量的差異，試驗中多以碳酸酐酶（carbonic anhydrase，CA）為內(nèi)對照，通過比較釋放區(qū)帶與CA 區(qū)帶掃描灰度的比值來定量［4］。

根據(jù)對全血或紅細胞處理方法的不同分為等滲再釋放、低滲再釋放和等低滲全程再釋放。等滲再釋放是指全血中的紅細胞或紅細胞樣本處于等滲的血漿或生理鹽水中；低滲再釋放是指在全血中加入不同比例的蒸餾水，使紅細胞處于低滲狀態(tài)，此時根據(jù)蒸餾水的比例不同，再釋放差異很大；等低滲全程再釋放是指同一樣本在等滲和低滲條件下同時做HRT，信息量明顯增加，能顯示出不同疾病之間的明顯差異。

根據(jù)電泳方向分為“單向再釋放”和“雙向再釋放”?！皢蜗蛟籴尫拧笔侵冈陔娪具^程中，電場方向不變；“雙向再釋放”是指在第一向電泳進行一段時間后，將電場方向旋轉(zhuǎn)90°繼續(xù)進行第二向電泳。為了區(qū)別于經(jīng)典的雙向電泳（等點聚焦-SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳），也稱之為“對角線電泳”［5-6］。這種方法避免了再釋放區(qū)帶與CA 的重疊，有利于定量分析。為了比較多個樣本間的差異，雙向電泳又分為單層（只加一個樣本）、雙層（加兩個樣本）或多層（加多個樣本）。此外，根據(jù)再釋放的電場方向與初釋放相同或相反又可分為“前進型再釋放”和“后退型再釋放”?！扒斑M型再釋放”指初釋放時血紅蛋白向正極泳動，停電／再通電后電極方向不變，再釋放出來的血紅蛋白繼續(xù)泳向正極方向?！昂笸诵驮籴尫拧敝竿ｋ姡偻姾?，陰陽極對調(diào)，這樣再釋放的血紅蛋白就退向負極。

2 不同患者血紅蛋白釋放試驗的比較研究

2.1 β-地中海貧血患者的血紅蛋白釋放試驗

地中海貧血（簡稱地貧）是單基因遺傳病，主要表現(xiàn)為由于珠蛋白合成障礙造成的貧血，分為α-地貧和β-地貧兩種。目前診斷地貧多采用擴增受阻突變系統(tǒng)與聚合酶鏈反應相結(jié)合的檢測方法。該方法準確、可靠［7］，但對試驗技能要求高，費用高昂，不適用于臨床地貧篩查［8］。本研究小組在對一例輕型β-地中海貧血患者血紅蛋白標本進行單向Hb電泳分析時，意外發(fā)現(xiàn)在停電-再通電后，其Hb 釋放量明顯多于其他人。之后對輕型β-地中海貧血患者血紅蛋白標本進一步進行了雙向Hb 再釋放的電泳分析，發(fā)現(xiàn)人為多次停電-再通電后，每次都釋放出Hb，并且釋放量均多于其他人，形成梯帶或竹節(jié)帶［1］。與此相反，球形紅細胞增多癥的患者HRT明顯減少（待發(fā)表）。這提示，紅細胞內(nèi)絕大多數(shù)未與細胞膜結(jié)合Hb在第一次電泳時就釋放出來，推測還有部分Hb與膜結(jié)合，在隨后的停電-再通電后（再釋放）才能逐步釋放出來，釋放量可能與疾病相關(guān)。近期試驗發(fā)現(xiàn)［9］，不同濃度戊二醛處理紅細胞后會降低Hb釋放，原因與戊二醛引起紅細胞膜磷脂與胞內(nèi)外蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)有關(guān)，據(jù)此研究人員推測HRT 中再釋放的Hb 可能是與細胞膜結(jié)合的Hb；另外，用不同濃度過氧化氫處理紅細胞后會增加Hb再釋放，這可能是由于膜脂質(zhì)過氧化導致更多Hb與膜結(jié)合［10］。

2.2 普通外科患者血紅蛋白釋放試驗

研究小組抽取18例普通外科住院患者靜脈血，分別進行等滲室溫HRT、等滲37 ℃HRT（即電泳前先將血液標本在37 ℃保溫12h）及低滲37 ℃HRT 等3種HRT 定點釋放，染色后觀察血紅蛋白釋放情況。在等滲室溫HRT 中（8例血液標本），有1例陽性；在等滲37 ℃HRT 中（10例血液標本），有3例陽性，其血液標本分別來自膽石癥、腸梗阻和脾破裂患者；而在低滲37 ℃HRT 中（10例血液標本同上），有5例陽性，其血液標本除來自膽石癥、腸梗阻、脾破裂患者外，還有膽總管結(jié)石和化膿性闌尾炎患者。試驗結(jié)果顯示各種水平HRT 的靈敏度不同：低滲37 ℃HRT 高于等滲37 ℃HRT，等滲37℃HRT 高于等滲室溫HRT。靈敏度不同，可能揭示不同層次的問題。等滲室溫HRT 時，多數(shù)臨床標本不出現(xiàn)陽性，一旦釋放增強，可能預示病情加重［11］。對不同患者的HRT 分析發(fā)現(xiàn)，同一疾病來源的血液標本并非總是陽性結(jié)果，提示HRT 的改變除與疾病相關(guān)外，可能更與其代謝異常相關(guān)。對于出現(xiàn)陽性結(jié)果的血液標本，是血漿中某種成分發(fā)生改變對HRT 產(chǎn)生了影響，還是紅細胞膜成分發(fā)生改變對HRT 產(chǎn)生了影響，都是需要進一步深入研究的問題。

2.3 慢性腎衰竭患者的血紅蛋白釋放試驗

慢性腎衰竭（chronic renal failure，CRF）是各種原發(fā)性或繼發(fā)性慢性腎疾患導致腎功能損害所出現(xiàn)的一系列癥狀和代謝紊亂組成的臨床綜合征［12］。本研究首先利用低滲HRT 五管法（使用蒸餾水對血液進行5種不同程度的稀釋）研究了CRF 患者與正常人紅細胞HRT 的差異。結(jié)果顯示，CRF 患者低滲HRT 與正常對照組相比出現(xiàn)異常，當水∶血為7∶3時，差異更為明顯。此外，研究者還利用低滲37 ℃HRT 一管法（水∶血為8∶2）比較了5例CRF與4例非CRF腎病患者的血紅蛋白釋放，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CRF患者的白蛋白前移和血紅蛋白釋放均強于非CRF腎病患者，這可能是由于CRF 患者血中多種毒素對紅細胞膜的作用［13］。為了進一步驗證這種推測，研究者觀察了CRF患者的血漿成分對非CRF腎病患者紅細胞HRT 的影響，結(jié)果顯示CRF患者的血漿成分似乎能夠影響紅細胞的血紅蛋白釋放［13］。CRF產(chǎn)生的毒素有3類，即水溶性物質(zhì)，不與蛋白質(zhì)結(jié)合的小分子物質(zhì)，中分子物質(zhì)和能與蛋白質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)。已知中分子物質(zhì)甲狀旁腺素能增加紅細胞內(nèi)鈣含量，進而影響其完整性，破壞紅細胞［14］，而能與蛋白質(zhì)結(jié)合的毒素是否會作用于紅細胞并影響HRT，有待于進一步研究確認。

2.4 肝硬化患者血紅蛋白釋放試驗

本研究共篩查了38例全血標本的HRT，發(fā)現(xiàn)一例肝功能多項異常的肝硬化伴腹水標本的HRT異常。然后研究小組利用等低滲全程試驗和雙層對角線電泳技術(shù)，比較了肝硬化患者和肝功正常血液標本的HRT，發(fā)現(xiàn)了明顯不同。肝硬化患者標本的“前進”和“后退”再釋放都增強。選取電泳效果最明顯的等低滲標本（水∶全血為14∶6）做對角線電泳，可清楚看到Hb后退成分的存在，說明肝硬化患者紅細胞中Hb的存在狀態(tài)明顯異常，前進再釋放釋放很多Hb后，后退再釋放又釋放出較多Hb［15］。肝硬化患者紅細胞的細胞膜、形態(tài)、聚集性等都發(fā)生了很大變化，血小板參數(shù)和紅細胞參數(shù)存在明顯異常，血細胞破壞增加，有明顯的出血傾向［16］，這些可能都會影響到HRT。肝硬化腹水是肝臟長期慢性進展性損害的結(jié)果，是肝硬化進入中晚期（失代償期）的標志［17］。今后需要進一步比較肝硬化不同時期患者的HRT，為進一步揭開HRT 的發(fā)生機制奠定理論基礎(chǔ)。

2.5 糖尿病患者的血紅蛋白釋放試驗

為了研究血糖濃度對HRT 的影響，研究小組選取10例糖尿病患者的血液標本，分別做全血和紅細胞的Hb梯帶再釋放。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，全血釋放幾乎沒有梯帶，而紅細胞釋放有梯帶且與血糖濃度相關(guān)。為了進一步研究血糖與HRT 的關(guān)系，研究小組觀察了等體積50、100、500g／L 的葡萄糖溶液作用正常紅細胞后的HRT。結(jié)果顯示，葡萄糖能使紅細胞的梯帶再釋放明顯增強，且隨著血糖濃度增大梯帶再釋放遞增［18］。糖尿病是以慢性血葡萄糖水平增高為特征的代謝性疾?。?9］。研究表明，糖尿病病人的高糖狀態(tài)能夠改變正常血液環(huán)境，導致血液流變學異常、紅細胞形態(tài)改變，進而導致紅細胞變形能力下降［20-21］，這樣也可能會影響紅細胞的HRT。此外，糖尿病患者往往血脂增高，是否也會影響紅細胞的HRT 還有待于進一步研究。

2.6 剖宮產(chǎn)前后血紅蛋白釋放試驗

本研究選取一例剖宮產(chǎn)孕婦，分別于剖宮產(chǎn)術(shù)前、術(shù)后1、5、13d采血，然后將4 份血液標本進行多層對角線電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)后5d標本在HbA1前方出現(xiàn)聯(lián)苯胺染色陽性成分。接著選取術(shù)后5d標本進行等低滲全程電泳，并對術(shù)后1d和5d的血液標本進行單向再釋放。結(jié)果顯示，術(shù)后5d標本出現(xiàn)聯(lián)苯胺染色陽性成分和白蛋白前麗春紅染色陽性成分［22］。推測白蛋白前的麗春紅染色陽性成分應為前白蛋白。前白蛋白為肝臟合成的一種“急性期反應蛋白質(zhì)”，半衰期很短，僅約1.9d。聯(lián)苯胺染色陽性成分應為血紅蛋白與結(jié)合珠蛋白的復合物，珠蛋白也是由肝臟合成的急性期反應蛋白，半衰期約為3.5d～4d。這兩種陽性反應物質(zhì)的出現(xiàn)，是對剖宮產(chǎn)手術(shù)的一種急性期反應。而是否手術(shù)不同，急性期反應蛋白出現(xiàn)天數(shù)不同，或其出現(xiàn)是否與不同患者的身體狀態(tài)相關(guān)，則需要進一步深入研究。

3 展望

目前，HRT 初步的臨床研究結(jié)果顯示很多患者均可以出現(xiàn)HRT 增加，雖然沒有找到其共同的規(guī)律，但可以初步確定血紅蛋白再釋放的改變與紅細胞的改變有關(guān)。然而，影響紅細胞狀態(tài)的因素有很多，除了成分復雜多樣的血漿外，血液流變學（包括紅細胞變形性和聚集性）的改變也會影響紅細胞［23］。那么，什么原因會改變血紅蛋白釋放？血紅蛋白釋放是否具有疾病特異性？這些問題都需要進一步的深入研究，從而為闡明血紅蛋白釋放的分子機制及其與疾病的關(guān)系奠定理論基礎(chǔ)，為紅細胞及Hb相關(guān)疾病的臨床診斷和治療提供新的依據(jù)。

［1］秦文斌，高麗君，蘇 燕，等.血紅蛋白釋放試驗與輕型β-地中海貧血［J］.包頭醫(yī)學院學報，2007，23（6）：561-563.

［2］Su Y，Shao G，Gao L，et al.RBC electrophoresis with discontinuous power supply a newly established hemoglobin release test［J］.Electrophoresis，2009，30（17）：3041-3043.

［3］Su Y，Gao L，Qin W.Protein electrophoresis：Methods in molecular biology：Interactions of hemoglobin in live red blood cells measured by the electrophoresis release test［M］.New York：Humana Press，2012.

［4］秦文斌.活體紅細胞內(nèi)血紅蛋白的電泳釋放［J］.中國科學生命科學，2011，41（8）：597-607.

［5］Su Y，Shen J，Gao L，et al.Molecular interactions of re-released proteins in electrophoresis of human erythrocytes［J］.E-lectrophoresis，2012，33（9-10）：1402-1405.

［6］Su Y，Gao L，Ma Q，et al.Interactions of hemoglobin in live red blood cells measured by the electrophoresis release test［J］.Electrophoresis，2010，31：2913-2920.

［7］王燕燕，李曉輝，徐西華.地中海貧血診治進展與我國現(xiàn)狀［J］.中國實用兒科雜志，2013，28（6）：473-476.

［8］甘 冰，毛錦江.新生兒臍血血紅蛋白電泳HbA 在篩查β-地中海貧血中的意義［J］.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2014，22（1）：75-76.

［9］魏春華，蘇 燕，楊 麗，等.不同濃度戊二醛對紅細胞血紅蛋白釋放的影響［J］.動物醫(yī)學進展，2014，35（2）：16-19.

［10］魏春華，蘇 燕，李曉晶，等.不同濃度過氧化氫處理紅細胞對血紅蛋白釋放的影響［J］.動物醫(yī)學進展，2014，35（3）：64-67.

［11］韓麗紅，閏 斌，高雅瓊，等.普通外科患者血紅蛋白釋放試驗的比較研究［J］.臨床和實驗醫(yī)學雜志，2009，8（7）：67-69.

［12］王海燕.腎衰竭［M］.上海：上海科學技術(shù)出版社，2003：290.

［13］王彩麗，高雅瓊，秦文斌，等.低滲血紅蛋白釋放試驗與慢性腎衰竭［J］.醫(yī)學綜述，2011，21（17）：3330-3332.

［14］陳 斌，李艷華，劉 楊.尿毒癥毒素研究進展［J］.吉林醫(yī)學，2013，34（22）：4513-4515.

［15］寶勿仁必力格，王翠峰，高麗君，等.肝硬化患者血紅蛋白釋放實驗明顯異常［J］.臨床和實驗醫(yī)學雜志，2011，10（24）：1915-1917.

［16］張廣蕾.淺談肝硬化腹水的中西醫(yī)結(jié)合治療［J］.當代醫(yī)學，2011，17（26）：144-145.

［17］李福林，張玉俠，田 謐.塌漬照射法對肝硬化腹水患者血清腹水白蛋白梯度、血小板參數(shù)及紅細胞參數(shù)的影響研究［J］.中國醫(yī)藥導報，2013，10（6）：4-6.

［18］張曉燕，高麗君，高雅瓊，等.血糖濃度和血紅蛋白釋放實驗的比對研究［J］.國際檢驗醫(yī)學雜志，2010，31（6）：524-525.

［19］雍軍光，阮 萍，馮博華，等.2型糖尿病患者紅細胞形態(tài)及胞膜彈性的變化及其臨床意義［J］.中國糖尿病雜志，2013，21（11）：998-1001.

［20］Jiang M，Jia L，Jiang W，et al.Protein disregulation in red blood cell membranes of type 2diabetic patients［J］.Biochem Biophys Res Commun，2003，309：196-200.

［21］Wandersee N J，Olson S C，Holzhauer S L，et al.Increased erythro-cyte adhesion in mice and humans with hereditary spherocytosis and hereditary elliptocytosis［J］.Blood，2004，103：710-716.

［22］葛 華，高麗君，羅 勁，等.剖宮產(chǎn)前后血紅蛋白釋放實驗的連續(xù)觀察［J］.臨床和實驗醫(yī)學雜志，2013，12（5）：362-365.

［23］王翠峰，高麗君，烏 蘭，等.血紅蛋白釋放實驗與血液流變學檢測結(jié)果相關(guān)性的研究［J］.中國醫(yī)藥導報，2010，7（4）：64-66.