基于分子印跡膜用于檢測(cè)組胺的電化學(xué)傳感器

姜隨意，寧保安，白家磊，彭媛，張娜，高志賢

（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所，天津市環(huán)境與食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300050）

基于分子印跡膜用于檢測(cè)組胺的電化學(xué)傳感器

姜隨意，寧保安，白家磊，彭媛，張娜，高志賢*

（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所，天津市環(huán)境與食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300050）

利用電化學(xué)傳感技術(shù)，對(duì)水樣中的組胺進(jìn)行檢測(cè)，為研發(fā)相應(yīng)的食品快檢技術(shù)與設(shè)備提供技術(shù)基礎(chǔ)。在金電極上制備分子印跡膜，應(yīng)用電化學(xué)進(jìn)行表征，建立電化學(xué)檢測(cè)組胺的方法。該方法檢出限：0.5 ng/mL，檢測(cè)范圍：0.5 ng/mL～50 ng/mL，檢測(cè)時(shí)間＜30min。所建立的方法對(duì)于檢測(cè)水樣的組胺具有靈敏度高、準(zhǔn)確度好和精密度高。

電化學(xué)傳感技術(shù)；組胺；分子印跡膜；食品快檢技術(shù)

組胺（Histamine，HA），又名組織胺，分子式：C5H9N3，化學(xué)名4（5）－（2－氨乙基）咪唑。組氨是一種生物胺，它是由組胺酸分解而成，而組氨酸是蛋白質(zhì)經(jīng)過分解后產(chǎn)生的一種氨基酸，組胺分子量小，只有111 Da[1]，組胺分子式及結(jié)構(gòu)類似物見圖1，食品中組胺主要是組氨酸在莫根氏變形桿菌、組胺無色桿菌等微生物和組氨酸脫羧酶等共同作用下發(fā)生脫羧反應(yīng)產(chǎn)生的。人體中組胺主要存儲(chǔ)于肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞中[2-3]，當(dāng)機(jī)體受到過敏原刺激時(shí)，會(huì)大量的產(chǎn)生組胺，局部濃度的增加導(dǎo)致過敏反應(yīng)[4]，眾所周知，組胺不僅作為速發(fā)型超敏反應(yīng)的一種細(xì)胞間化學(xué)介質(zhì)[5]，而且也是大腦中的神經(jīng)遞質(zhì)，大腦中濃度達(dá)到1μmol/kg～6μmol/kg[6]。組胺有毒性，可以降低血壓，當(dāng)有機(jī)體攝入組胺超過100mg（或每千克體重1.5mg）時(shí)，即可引起食物中毒[7]。在由生物胺導(dǎo)致的食品安全問題中，組胺對(duì)人類的健康的影響最大。全國(guó)曾多次發(fā)生過組胺食物中毒事件。世界上很多國(guó)家對(duì)食品中組胺含量做了限量要求：美國(guó)FDA要求水產(chǎn)品中組胺含量不得超過50mg/kg[8]；歐盟規(guī)定鯖科魚類中組胺含量不得超過100mg/kg，其它食品中的組胺含量不得超過100mg/kg～800mg/kg；我國(guó)規(guī)定鮐魚中組胺含量不得超過100mg/100 g，其它魚類不得超過30mg/100 g。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，組胺是一種自然產(chǎn)生的物質(zhì)，在許多蔬菜、水果、啤酒、魚、奶酪和紅葡萄酒中都能產(chǎn)生組胺[7]，為了給食品加工生產(chǎn)時(shí)的危害分析臨界控制點(diǎn)（HACCP）認(rèn)證提供科學(xué)依據(jù)，在食品和食品加工行業(yè)，快速、準(zhǔn)確、可靠的檢測(cè)組胺顯得十分必要。組胺的檢測(cè)方法主要有：有偶氮試劑比色法、熒光分光光度法、高效液相色譜法（HPLC法）[9]、氣相色譜法（GC）[10]、薄層色譜法（TLC）、酶聯(lián)免疫方法（ELISA法）[11]、毛細(xì)管電泳法（CE）和生物學(xué)法等。這些方法所用試劑、器皿較多，操作繁瑣、費(fèi)時(shí)、靈敏度低。另外，我國(guó)現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法是GB/T5009.45-2003和國(guó)標(biāo)《水質(zhì)組胺等五種生物胺的測(cè)定高效液相色譜法》（GB/T21970-2008），目前還沒有應(yīng)用電化學(xué)法檢測(cè)食品中組胺的標(biāo)準(zhǔn)，在國(guó)內(nèi)外的文獻(xiàn)檢索中，應(yīng)用電化學(xué)法檢測(cè)食品中組胺的方法也很少，電化學(xué)法有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、快速等優(yōu)點(diǎn)，因此建立食品中組胺的電化學(xué)法檢測(cè)方法十分必要，本項(xiàng)目采用電化學(xué)法開展了這一方法標(biāo)準(zhǔn)化的研究和起草工作。

圖1 組胺及其結(jié)構(gòu)類似物Fig.1 Structuresof histaMineand structuralanalogs

在本項(xiàng)目中，我們建立了基于分子印跡膜檢測(cè)組胺的電化學(xué)傳感器，相對(duì)于傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)提出了一個(gè)新的發(fā)展空間。含有大量印跡孔穴的分子印跡聚合物（MIPs）是人工合成受體，它具有類似天然抗體或酶的特異性和選擇性[12]，這種含有合成識(shí)別元件的仿生傳感器可以在各種惡劣的環(huán)境中使用。MIPs包含大量的印跡孔穴，這些孔穴能夠通過形狀、大小和官能團(tuán)（如氫鍵）與靶分子進(jìn)行互補(bǔ)，它特別適用于小分子的檢測(cè)[13]。在目標(biāo)分子存在的情況下，電阻抗會(huì)發(fā)生變化，這些變化可以通過電化學(xué)傳感器表征。該方法有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：首先，MIPs合成成本低[14]；第二，MIPs具有較好的穩(wěn)定性，能承受極端的溫度和pH環(huán)境[15]；第三，MIPs是通過非共價(jià)鍵的方法制備，具有良好的再生性[16]。至今，基于MIPs檢測(cè)組胺的文獻(xiàn)很少，本研究還研究了pH對(duì)檢測(cè)組胺的影響。該傳感器加入0.1MHCl溶液再生后可重復(fù)使用。我們成功地實(shí)現(xiàn)了對(duì)組胺的檢測(cè)，檢測(cè)限為0.5 ng/mL。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

組胺標(biāo)準(zhǔn)品、11-巰基十一烷酸（MUA）、單體甲基丙烯酸（MAA）、交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）、引發(fā)劑2，2-偶氮雙（2-甲基丙脒）鹽酸鹽（AIBA）（美國(guó)Sigma-Aldrich公司），1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）（阿拉丁試劑上海有限公司），結(jié)構(gòu)類似物5-羥色胺、1-咪唑乙酸、5-羥基吲哚乙酸、組胺酸（美國(guó)Sigma-Aldrich公司），其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，使用前未經(jīng)純化處理，實(shí)驗(yàn)用水為18.3MΩ·cm超純水。

1.2 主要儀器

電化學(xué)工作站：荷蘭IVIUMTECHNOLOGIESBV公司；Ag/AgCl電極、鉑絲電極：上海辰華儀器有限公司；金電極：天津艾達(dá)恒晟科技發(fā)展有限公司；電熱真空干燥箱：天津天宇機(jī)電有限公司；Eppendorf移液器：德國(guó)Eppendorf公司；超聲波清洗機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；其林貝爾脫色搖床：江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司；AL-204分析天平：美國(guó)METTLER TOLEDO。

1.3 方法

1.3.1 金電極的處理

用藥匙取少量Al2O3粉于麂皮上，加少量蒸餾水潤(rùn)濕，將清洗干凈的電極在麂皮上“8”字形打磨，打磨好金電極后，用蒸餾水沖洗，將金電極在1MH2SO4體系中進(jìn)行清洗，循環(huán)伏安法掃描電位為-0.2 V~1.2 V，穩(wěn)定后將金電極放入0.5MH2SO4體系中進(jìn)行活化，循環(huán)伏安法掃描電位為-0.2V~1.6V，掃描穩(wěn)定后活化完畢，H2SO4體系實(shí)驗(yàn)前均用N2除氧10min。

1.3.2 分子印跡膜的制備

將金電極放入1mM的MUA乙醇溶液中反應(yīng)過夜，清洗干凈后，加入400mMEDC、100mMNHS混合液（1∶1，v/v）中避光振蕩活化1 h，然后將金電極加入含有200mM的AIBA水溶液中反應(yīng)3 h，反應(yīng)完畢后，將金電極放入含有組胺（0.2mmol）、MAA（0.4mmol）、EGDMA（0.8mmol）及DMSO（5mL）的預(yù)聚合液中，氮?dú)獬?0min后，放入60℃反應(yīng)16 h，然后用甲醇/冰乙酸（9∶1，v/v）洗脫模板分子，制備得到分子印跡膜，應(yīng)用這種材料檢測(cè)組胺，非印跡膜的制備沒有加入組胺，其它方法同前。

1.3.3 最佳pH的篩選

將濃度為5 ng/mL的組胺溶液的pH分別調(diào)到4~ 12后，再將修飾好后的金電極分別浸泡10min，然后再進(jìn)行電化學(xué)表征。

1.3.4 電阻抗（EIS）法表征

將不同梯度濃度的組胺標(biāo)準(zhǔn)液（0.5、1.0、2.5、5.0、10、25、50ng/mL）分別與修飾好后的金電極反應(yīng)10min，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)量3次，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立檢測(cè)范圍，計(jì)算出最低檢測(cè)限值。

1.3.5 精密度實(shí)驗(yàn)

通過修飾的金電極對(duì)5 ng/mL組胺進(jìn)行EIS表征，洗脫和再生5次后，觀察電阻抗的變化，評(píng)價(jià)該檢測(cè)方法的精密度。

1.3.6 干擾實(shí)驗(yàn)

應(yīng)用MIP膜、NIP膜對(duì)10倍濃度的干擾物與組胺的檢測(cè)進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)MIP膜對(duì)組胺檢測(cè)的選擇性。

2 結(jié)果

2.1 最佳pH的選擇

pH的變化對(duì)該傳感器的影響較大，隨著pH的變化EIS表征會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化，組胺在不同的pH形態(tài)會(huì)發(fā)生變化，組胺的等電點(diǎn)為6.9和10.4[17]，當(dāng)pH＞10.4時(shí)，組胺以其天然的形態(tài)出現(xiàn)，當(dāng)pH＜6.9時(shí)，組胺含有2個(gè)質(zhì)子，當(dāng)pH位于二者之間時(shí)，組胺含有1個(gè)質(zhì)子。將濃度為5 ng/mL的組胺溶液的pH分別調(diào)到4～12后，與金電極反應(yīng)完畢后進(jìn)行電化學(xué)表征，見圖2。

圖2 pH對(duì)基于MIP膜的電化學(xué)傳感器檢測(cè)組胺的影響Fig.2 ElectrocheMicalsensor responseof theMIP fliMin varying pH conditions

pH位于7～9時(shí)，電阻抗的變化明顯好于其他pH，pH位于8時(shí)，達(dá)到最佳檢測(cè)效果，由此可見，含有1個(gè)質(zhì)子的組胺能夠很好的與MIP膜結(jié)合。

2.2 吸附響應(yīng)實(shí)驗(yàn)

應(yīng)用EIS對(duì)不同濃度組胺的表征如圖3所示。

可見各個(gè)濃度對(duì)應(yīng)的EIS響應(yīng)信號(hào)成梯度變化，根據(jù)EIS響應(yīng)信號(hào)的變化，繪制出了劑量響應(yīng)曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示。

由圖可以看出，劑量響應(yīng)曲線的形狀不是一條筆直的直線，而是一個(gè)典型的等溫結(jié)合反應(yīng)曲線，初始激烈的信號(hào)上升，隨后逐漸出現(xiàn)飽和平穩(wěn)，將濃度進(jìn)行對(duì)數(shù)變換后，繪制出了標(biāo)準(zhǔn)曲線，公式為：y= 3.440lgx+1.283，R2=0.997，組胺的檢測(cè)范圍為：0.5ng/mL～ 50 ng/mL，檢測(cè)限值：0.5 ng/mL。檢測(cè)限值的計(jì)算方法根據(jù)IUPAC的要求：CL=Cn+tSn/（n）1/2，CL為最低檢測(cè)限，Cn為最低可檢測(cè)的濃度，t值選用的是95%可信區(qū)間范圍，n是檢測(cè)的樣品數(shù)（n=5），Sn是測(cè)量5個(gè)樣品的標(biāo)準(zhǔn)差。

圖3 EIS對(duì)不同濃度組胺的表征圖Fig.3 EIS characterization of different concentrationsof histaMine

圖4 電化學(xué)傳感器檢測(cè)組胺的響應(yīng)曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Response curveand calibration curveof the present electrocheMicalsensor for histaMine

2.3 選擇性實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)分別用MIP膜、NIP膜修飾的金電極作為識(shí)別元件，檢測(cè)不同濃度的組胺水溶液，比較結(jié)果如圖5所示。

圖5 MIP膜與NIP膜對(duì)組胺檢測(cè)的選擇性比較Fig.5 Selectivity coMparison ofMIP filMand NIP filMfor histaMine

由圖可以看出，MIP膜對(duì)組胺的選擇性明顯好于NIP膜，說明制作的MIP膜對(duì)組胺有吸附作用。應(yīng)用MIP膜、NIP膜對(duì)10倍濃度的干擾物與組胺的檢測(cè)進(jìn)行比較如圖6所示。

圖6 組胺與結(jié)構(gòu)類似物的電阻抗變化的比較Fig.6 The iMpedanceshiftof histaMineand structuralanalogues

MIP膜對(duì)組胺的選擇性好，特異性高。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

通過修飾的金電極對(duì)5 ng/mL組胺進(jìn)行EIS表征，洗脫和再生5次后，電阻抗的變化如圖7所示。

圖7 連續(xù)測(cè)定5 ng/ML組胺的EIS表征圖Fig.7 EIS response for successive detectionsof 5 ng/MLof histaMine

第1次與第5次檢測(cè)，電阻抗變化很小，表明該MIP膜的精密度高、穩(wěn)定度好。

3 討論

通過對(duì)檢測(cè)條件的優(yōu)化，制備了高特異性快速響應(yīng)的分子印跡電化學(xué)傳感器，建立了檢測(cè)組胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線，最低檢測(cè)限為：0.5 ng/mL，檢測(cè)范圍：0.5 ng/mL～50 ng/mL。選擇性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該材料對(duì)結(jié)構(gòu)類似物無明顯的交叉反應(yīng)性，并且洗脫和再生5次后仍對(duì)組胺有吸附性，還可以進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，提高分子印跡膜的穩(wěn)定性，該方法可作為快速檢測(cè)食品中組胺的方法之一。

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ElectrocheMical Sensor for the Detection of HistaMine Based on Molecularly Imprinted Polymer Film

JIANGSui-yi，NINGBao-an，BAIJia-lei，PENGYuan，ZHANGNa，GAOZhi-xian*
（Tianjin Key LaboratoryofRisk Assessmentand Control Technology for Environmentand Food Safety，Institute ofHealth and EnvironmentalMedicine，Tianjin 300050，China）

In thepurposeofproviding fastdetection technologyandequipment，adetectionmethod forhistaminein water samplesusing electrochemical sensorwas established.Molecularly imprinted polymer（MIP）filmswere preparedon thegoldelectrode，andwerecharacterizedbyelectrochemicalmethod.Electrochemicalmethod for the detection ofhistaminewasestablished.TheminimuMdetection limitof theestablishedmethodwas0.5 ng/mL.The sensing techniqueallows for thedetection ofhistamine in thewide range froM0.5 ng/mL to50 ng/mLand detection time lessthan30min.Theestablisheddetectionmethod forhistamineinwatersensitive，accurate，andprecise.

electrochemicalsensing technology；histamine；molecularly imprinted polymer（MIP）films；food fastdetection technology

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.18.019

2014-09-15

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目（2012AA101604）

姜隨意（1982—），男（漢），醫(yī)師，在讀碩士研究生，研究方向：食品安全關(guān)鍵技術(shù)研究。

*通信作者