野生苦菜體外抗氧化及抑制腫瘤活性研究

陳瓊，闞聰，2，寇曉虹，*，王庚

（1.天津大學(xué)化工學(xué)院食品科學(xué)系，天津300072；2.海南大學(xué)食品學(xué)院食品科學(xué)與工程系，海南海口570228）

野生苦菜體外抗氧化及抑制腫瘤活性研究

陳瓊1，闞聰1，2，寇曉虹1，*，王庚1

（1.天津大學(xué)化工學(xué)院食品科學(xué)系，天津300072；2.海南大學(xué)食品學(xué)院食品科學(xué)與工程系，海南?？?70228）

以野生苦菜為原料，采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）清除能力、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）清除能力、羥基自由基清除能力和鐵離子還原能力法評(píng)定其抗氧化能力，采用3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）法評(píng)定苦菜提取物對(duì)雌激素依賴性人類乳腺癌細(xì)胞MCF-7和雌激素非依賴性人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的抑制活性。結(jié)果表明，苦菜甲醇提取物對(duì)ABTS、DPPH都具有較強(qiáng)的清除能力，且具有較強(qiáng)的鐵離子還原能力，對(duì)雌激素依賴性人類乳腺癌細(xì)胞MCF-7和雌激素非依賴性人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231均有顯著的抑制活性?？嗖说募状继崛∥飳?duì)MCF-7和MDA-MB-231半抑制率分別為99、107μg/mL。

苦菜；抗氧化；抑制腫瘤

苦菜，學(xué)名Ixeris Sonchifolia，為菊科苦苣屬的一年生或兩年生草本植物，又稱為苦荬菜、苣荬菜[1]。分布于中國東北、華北，華東和華南等省區(qū)?？嗖?，味微苦，是著名的中藥，對(duì)糖尿病、心腦血管病、動(dòng)脈硬化等多種中老年疾病以及由細(xì)菌引起的各種炎癥、失眠、神經(jīng)衰弱等疾病都有很好的預(yù)防和治療作用[2]。然而，目前總體關(guān)于苦菜的研究較少且大多在國內(nèi)。國內(nèi)外關(guān)于苦菜的研究有苦菜所含成分的分析[3-5]、倍半萜烯的分離鑒定[6]、苦菜黃酮測(cè)定及抗氧化作用[7]，苦菜黃酮對(duì)缺血再灌注損傷保護(hù)作用[8-9]，人體嗜中性粒細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用[10]，及苦菜提取物在抗凝血[11]、抑菌[12]、抗炎[13]等方面的作用，然而還缺乏苦菜尤其是野生苦菜抑制人乳腺癌細(xì)胞活性的報(bào)道，對(duì)其抑制乳腺腫瘤作用缺乏全面的了解。本文用甲醇提取野生苦菜中活性成分，并用甲醇提取物對(duì)苦菜抗氧化及人類乳腺癌細(xì)胞活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為野生苦菜資源的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 植物材料

野生苦菜：采自山西省懷仁縣。

1.1.2 化學(xué)試劑

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、Trolox、Tris、乙二胺四乙酸（EDTA）、Vitamine C（VC）、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、小牛血清（FBS）、1640培養(yǎng)基、脫氧核糖（2-Deoxy-D-ribose：DR）、硫代巴比妥酸（TBA）、齊墩果酸均為分析純，購買于美國sigma公司（St.Louis，Mo.，U.S.A.）；甲醇、六氰合鐵酸鉀、三氯乙酸、過硫酸鉀、二甲基亞砜、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鹽酸、過氧化氫、鄰苯三酚、氯化鐵、蒸餾水均為分析純購于天津市江天化工技術(shù)有限公司（天津，中國）。

1.1.3 腫瘤細(xì)胞

雌激素依賴性人類乳腺癌細(xì)胞MCF-7，雌激素非依賴性人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231（南開大學(xué)生命科學(xué)院惠贈(zèng)）。

1.1.4 主要儀器

FD-1C-50型冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；HERACELL 150iCO2培養(yǎng)箱、MULTISKAN FC酶標(biāo)儀：Thermo Scientific；HH型數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠。

2 方法

2.1 苦菜的甲醇提取物制備

取新鮮苦菜4 kg，冷凍干燥，破粹成粉，過80目篩，按料液比1∶10（g∶mL）加入甲醇，于室溫下攪拌提取8 h，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮提取液，即得甲醇相提取物（MF），重復(fù)上述過程共得提取物，冷凍干燥后置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 苦菜提取物抗氧化活性的研究

DPPH自由基清除能力的測(cè)定方法參考Yu L．等和Hu Jikai等方法[14-15]；羥基自由基清除能力的測(cè)定參考郭麗萍等方法[16]；ABTS自由基清除能力的測(cè)定參考Roberta re Nicoletta Pellegrini等方法[17]；總還原能力的測(cè)定參考馮翠萍等方法[18]。

2.3 苦菜提取物抗癌活性的研究

采用MTT法評(píng)價(jià)提取物抑制腫瘤增殖能力[19-20]。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF-7均以0.25%胰蛋白酶消化，然后用RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%FBS）稀釋至濃度為2.5×105/mL的細(xì)胞懸液。于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中以每孔100μL的量加樣，然后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)8 h~10 h。實(shí)驗(yàn)組每孔添加新的含不同濃度樣品的完全培養(yǎng)基100μL，對(duì)照組每孔添加等體積的完全培養(yǎng)基，每組設(shè)有3個(gè)復(fù)孔，置于37℃、5%CO2條件下連續(xù)培養(yǎng)96 h。培養(yǎng)結(jié)束，棄上清液，每孔加入5mg/mL的含無血清培養(yǎng)基的MTT溶液20μL，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。取出后每孔分別加入DMSO 150μL，輕輕震蕩10min使沉淀溶解，在酶標(biāo)儀上波長(zhǎng)570 nm處檢測(cè)光密度OD值，計(jì)算抑制率。

抑制率（%）=（1-OD1/OD2）×100%

式中：OD1代表測(cè)得的樣品組吸光度值；OD2代表對(duì)照組的吸光度值。

3 結(jié)果與分析

3.1 苦菜甲醇提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力

DPPH自由基清除法是一種廣泛用于測(cè)定樣品的清除自由基能力的方法。DPPH自由基是可以穩(wěn)定存在于有機(jī)溶劑中的、以氮為中心的自由基，其甲醇溶液呈深紫色，特征吸收峰出現(xiàn)在波長(zhǎng)517 nm處，當(dāng)其遇到自由基清除劑時(shí)，孤對(duì)電子配對(duì)，其最大吸收波長(zhǎng)處的吸收會(huì)消失或減弱。由此可見，通過測(cè)定吸收減弱的程度，可以評(píng)價(jià)該自由基清除劑清除能力的強(qiáng)弱[21]。

圖1 不同濃度苦菜甲醇提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.1 DPPH free radicalscavenging capacity under different concentration of Ixeris Sonchifolia extracts

如圖1所示，濃度在0.05mg/mL~0.2mg/mL苦菜甲醇提取物對(duì)DPPH自由基有明顯的清除效果，并且呈現(xiàn)顯著劑量效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)濃度達(dá)到0.2mg/mL時(shí)清除能力最強(qiáng)（達(dá)到0.9），濃度大于0.2mg/mL后對(duì)DPPH自由基的清除趨勢(shì)趨于平緩。

3.2 苦菜甲醇提取物對(duì)羥基自由基的清除能力

如圖2所示，隨苦菜甲醇提取物濃度增大，其對(duì)羥基自由基的清除率無明顯增加，羥基自由基率與濃度沒有明顯劑量依賴性關(guān)系，說明苦菜提取物對(duì)羥基自由基沒有顯著的清除效果。

圖2 不同濃度苦菜甲醇提取物對(duì)羥基自由基的清除能力Fig.2 Hydroxyl free radicalscavenging capacity under different concentration of IxerisSonchifolia extracts

3.3 苦菜甲醇提取物對(duì)ABTS自由基的清除能力

圖3 不同濃度苦菜甲醇提取物對(duì)ABTS自由基的清除能力Fig.3 ABTS radicalscavenging capacity under different concentration of IxerisSonchifolia extracts

ABTS常被食品工業(yè)和農(nóng)業(yè)的科研工作者用于評(píng)價(jià)食品的抗氧化性[22]。加入過硫酸鈉，ABTS可以轉(zhuǎn)化成藍(lán)色的自由基陽離子形式，在734 nm處有吸收峰[23]。ABTS和抗氧化物質(zhì)如多酚、硫醇或VC有很強(qiáng)的反應(yīng)活性，并反映轉(zhuǎn)化成無色的中性離子形式[24]，因此可以用比色法進(jìn)行抗氧化評(píng)定。

如圖3所示，苦菜甲醇提取物在0.01 mg/mL～0.4 mg/mL范圍內(nèi)隨著濃度不斷增加，提取物對(duì)于ABTS清除能力也不斷增加，呈現(xiàn)明顯劑量依賴性關(guān)系。由此可知，苦菜提取物對(duì)ABTS自由基有著較強(qiáng)的清除能力。

3.4 苦菜甲醇提取物對(duì)總還原能力的影響

對(duì)鐵離子還原過程將K3Fe（CN）6還原成黃血鹽K4[Fe（CN）6]，再利用Fe2+形成普魯士藍(lán)Fe4（Fe（CN）6。以普魯士藍(lán)生成量作為指標(biāo)。700 nm吸光值反映普魯士藍(lán)的生成量，吸光度值越大，樣品還原力值愈強(qiáng)，表示抗氧化效果愈佳[25]。

如圖4所示，苦菜甲醇提取物在0.01 mg/mL～0.4 mg/mL范圍內(nèi)，隨著濃度不斷增加，提取物對(duì)于鐵離子還原能力也不斷增強(qiáng)，呈現(xiàn)明顯劑量依賴性關(guān)系。

圖4 不同濃度苦菜甲醇提取物的總還原能力Fig.4 Total reducing power under different concentration of IxerisSonchifolia extracts

3.5 苦菜甲醇提取物對(duì)MDA-MB-231的抑制效果

圖5 不同濃度苦菜甲醇提取物對(duì)MDA細(xì)胞存活率影響Fig.5 Effectof different concentration of Ixeris Sonchifolia extractson Inhibition ratio of huMan breast cancer MDA-MB-231

如圖5所示，與空白對(duì)照組相比，隨苦菜甲醇提取物濃度（0～180μg/mL）不斷增大，雌激素非依賴性人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的存活率不斷下降，呈現(xiàn)顯著地劑量效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)甲醇提取物濃度達(dá)180μg/mL，MDA-MB-231細(xì)胞的存活率為30.4%。由此可見，苦菜甲醇提取物對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞有明顯的抑制活性。顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖，提取物對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的半抑制率IC50為99μg/mL。

3.6 苦菜甲醇提取物對(duì)MCF-7抑制效果

圖6 不同濃度苦菜甲醇提取物對(duì)MCF-7細(xì)胞存活率的影響Fig.6 Effectof different concentration of IxerisSonchifolia extractson Inhibition ratio of human breast cancer MCF-7

由圖6可知，隨苦菜甲醇提取物濃度（0～180μg/mL）不斷增大，雌激素依賴性人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的存活率不斷減小，成劑量效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)甲醇提取物濃度達(dá)180μg/mL，MCF-7細(xì)胞的存活率為34.2%。由此可見，苦菜甲醇提取物對(duì)MCF-7細(xì)胞有明顯的抑制活性。提取物對(duì)MCF-7細(xì)胞的IC50為107μg/mL。如圖5、6可知，苦菜的甲醇提取物對(duì)MDA-MB-231和MCF-7這兩種癌細(xì)胞的活性有較好的抑制作用。當(dāng)苦菜的濃度增加至180μg/mL時(shí)，兩種癌細(xì)胞的存活率均降至30%左右。

4 結(jié)論

本文研究結(jié)果表明，苦菜甲醇提取物對(duì)ABTS和DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除能力，且具有較強(qiáng)的鐵離子還原能力，說明實(shí)驗(yàn)用苦菜有良好的抗氧化活性?？嗖思状继崛∥锎萍に匾蕾囆匀祟惾橄侔┘?xì)胞MCF-7和雌激素非依賴性人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231均有顯著的抑制活性。因此，野生苦菜作為天然抑癌化合物的篩選材料具有潛在價(jià)值。

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The Antioxidant and Tumor Inhibiting Activity ofW ild Ixeris Sonchifolia

CHENQiong1，KANCong1，2，KOU Xiao-hong1，*，WANGGeng1
（1.Food Science，SchoolofChemicalengineeringand Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China；2.Departmentof Food Science and Engineering，Schoolof Food，Hainan University，Haikou 570228，Hainan，China）

Thewild Ixeris Sonchifolia（froMShanxi，China）was used to evaluate itsantioxidantactivity and tumor inhibiting activity.The antioxidant activity was evaluated using the 2，2-diphenyl-1-picrylhydracyl（DPPH·），hydroxyl free radical（OH·）and 2，2'-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid）（ABTS·+）scavengingmethods and the ferric reducing antioxidant power assay.3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazoliuMbromide（MTT）assay was employed to evaluate its tumor inhibiting activity.The results showed that the Ixeris Sonchifolia extracts had excellent DPPH·，ABTS·+scavenging capacity and reducing power.The Ixeris Sonchifolia extracts can significantly inhibit human breast tumor MDA-MB231（estrogenindependent tumor）and MCF-7（estrogen-dependent tumor）.The IC50（halfmaximal inhibitory concentration）ofMDA-MB231 andMCF-7were99and 107μg/mL，respectively.

Ixeris Sonchifolia；antioxidantactivity；anticancer

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.18.005

2014-09-15

陳瓊（1990—），男（漢），在讀碩士研究生，研究方向：功能性食品。

*通信作者：寇曉虹，碩導(dǎo)，博士。