Rac1雙向調(diào)控NADPH氧化酶和eNOS研究進(jìn)展

蘭潮棕，高 杉

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230031；2.安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，安徽 合肥 230032）

◇綜述與講座◇

Rac1雙向調(diào)控NADPH氧化酶和eNOS研究進(jìn)展

蘭潮棕1，高 杉2

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230031；2.安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，安徽 合肥 230032）

GTP結(jié)合蛋白（GTP binding protein，G protein），簡(jiǎn)稱G蛋白，是細(xì)胞外信號(hào)通過膜受體轉(zhuǎn)入胞內(nèi)的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，體內(nèi)眾多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑均有 G蛋白參與。小分子 G蛋白的分子量一般在2.0×104～3.0×104，為 G蛋白分子量的 1／4至 1／3，因此得名，簡(jiǎn)稱小 G蛋白。小 G蛋白為單鏈結(jié)構(gòu)，同時(shí)具有 GTP酶活性和與GTP、GDP結(jié)合的特性。Rho是小G蛋白（small GTPases）家族中的重要成員，而且它是最早被發(fā)現(xiàn)的Ras同源蛋白（Ras homologue）。Rac1是Rho家族的成員之一，它作為eNOS和 Nox的一個(gè)共同的控制元件，協(xié)調(diào)參與了內(nèi)皮細(xì)胞中 NO和 O-2產(chǎn)生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

Rac1；NADPH氧化酶；eNOS；綜合調(diào)節(jié)

小G蛋白（small GTPases）家族中的 Rho是真核生物中非常重要的信號(hào)蛋白，它可調(diào)節(jié)一系列的細(xì)胞行為，比如細(xì)胞骨架的重組，細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)以及細(xì)胞黏附。通過這些作用，Rho GTPases可以協(xié)調(diào)細(xì)胞遷移、軸突生長(zhǎng)以及腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［1-2］。Rac1是小G蛋白家族中 Rho的成員之一。目前研究發(fā)現(xiàn)，Rac1作為 eNOS和NADPH氧化酶的一個(gè)共同的控制元件，協(xié)調(diào)參與了內(nèi)皮細(xì)胞中 NO和 O-2產(chǎn)生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［3］。本文針對(duì) Rac1調(diào)控NADPH氧化酶以及eNOS的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1 Rac1的激活與作用

1.1 Rac1的激活 Rac1與二磷酸鳥嘌呤核苷（guanosine diphosphate，GDP）結(jié)合時(shí)失活，與三磷酸鳥嘌呤核苷（guanosine triphosphate，GTP）結(jié)合時(shí)激活。它就相當(dāng)于一個(gè)分子開關(guān)，其生物學(xué)功能的發(fā)揮依賴于這兩種形式間的相互轉(zhuǎn)換。鳥嘌呤核苷酸交換因子（guanine nucleotide exchange factors，GEFs）和鳥嘌呤核苷酸激活蛋白（GTPase activating proteins，GAPs）是小 G蛋白的關(guān)鍵調(diào)控因子。GEFs可促進(jìn) Rac1轉(zhuǎn)化為有活性的GTP結(jié)合狀態(tài)，而GAPs則增加GTPase分子內(nèi)部的 GTP水解，使 GTPase失活而關(guān)閉信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促使 Rac1轉(zhuǎn)化為無(wú)活性的GDP結(jié)合狀態(tài)［4］。

1.2 Rac1的作用 Rac1具有兩個(gè)主要功能：（1）調(diào)控肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)；Rac1通過發(fā)送下游信號(hào)到維—奧德里奇綜合征蛋白家族的富脯同源蛋白（Wiskott-Aldrich syndrome protein family verprolin-homologous protein，WAVE）復(fù)合物，激活肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白2和3復(fù)合體（actin related protein 2 and 3 complex，ARP 2／3），導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白聚合［5-6］。與此同時(shí)，Rac1激活了 p21活化激酶（p21 activated kinase，PAK），并使LIM激酶（Lim kinase，LIMK）磷酸化，從而減少肌動(dòng)蛋白核蛋白絲的翻轉(zhuǎn)并抑制絲切蛋白（Cofilin）的合成。Rac1在增加肌動(dòng)蛋白聚合的同時(shí)減少肌動(dòng)蛋白的翻轉(zhuǎn)，得以調(diào)控片狀偽足的形成。除此之外，Rac1在調(diào)節(jié)細(xì)胞連接、細(xì)胞黏附和運(yùn)動(dòng)等方面起到了非常重要的作用［7］。盡管小 G蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是通過單獨(dú)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑完成的，但他們之間的相互作用在調(diào)節(jié)細(xì)胞的極性，細(xì)胞膜皺褶的形成，細(xì)胞擴(kuò)散和運(yùn)動(dòng)等方面都是至關(guān)重要的。事實(shí)上，細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)依賴 Rac，RhoA活性，和 Rho家族的成員 Cdc42之間活動(dòng)的精細(xì)平衡［8］。有關(guān)研究表明，RhoA蛋白可誘導(dǎo)肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase，MLCK）活化，從而導(dǎo)致細(xì)胞收縮性增加。而 Rac1的活性調(diào)節(jié)將降低 MLCK活性，導(dǎo)致細(xì)胞收縮下降。因此，Rac1對(duì)RhoA的行動(dòng)產(chǎn)生了拮抗作用［9］。（2）與 NADPH氧化酶相互作用產(chǎn)生過氧化物；Rac和Cdc42之間存在相互作用。Rac1還可能與細(xì)胞色素 b558相互作用，這種跨膜蛋白與 Nox2、p22phox和 p67phox共同產(chǎn)生超氧化物。一項(xiàng)研究表明，Cdc42作為Rac1和 Rac2的一種競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，結(jié)合細(xì)胞色素 b558從而抑制超氧化物的合成［10］。

2 NADPH氧化酶

2.1 NADPH氧化酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) NADPH氧化酶是由膜亞基 gp91phox［11］和 p22phox，胞漿內(nèi)亞基p47phox、p67phox、p40phox和小分子 GTPases結(jié)合蛋白 Rac等組成的酶復(fù)合體，亞基 gp91phox及其同系物Nox1、Nox2、Nox3、Nox4、Nox5、Duox1和Duox2被稱為 Nox家族，該家族蛋白幾乎分布于所有器官、組織和細(xì)胞［12］。但是不同的亞型在組織中的分布存在明顯的優(yōu)勢(shì)分布。比如心肌細(xì)胞上主要是Nox2，而內(nèi)皮細(xì)胞上主要是 Nox4和Nox2。與心血管疾病相關(guān)的關(guān)鍵的 Nox同系物包括 Nox1、Nox2、Nox4和 Nox5。Nox1 p22phox復(fù)合物與 Rac1復(fù)合在細(xì)胞基質(zhì)里產(chǎn)生超氧化物。Nox4 p22phox復(fù)合物成型后不綁定在細(xì)胞質(zhì)中的任何亞基蛋白上，并且可以產(chǎn)生過氧化氫。Nox5的獨(dú)特之處在于它的激活不需要其他 NADPH氧化酶亞基的存在。因?yàn)镹ox5產(chǎn)生的ROS會(huì)隨著鈣離子濃度的增加而增加，這是由于Nox5獨(dú)特的N末端擁有四個(gè)EF-手性Ca2+結(jié)合結(jié)構(gòu)域［EF-hand，named arbitrarily after the E and F regions（helix-loop-helix Ca2+-binding motif）of parvalbumin］。其中，鈣調(diào)蛋白起到了一定作用，它是一種鈣離子結(jié)合信使蛋白，增加了 Ca2+的敏 感性［13］。

2.2 NADPH氧化酶的激活和組裝 Nox和p22phox都有六個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，一個(gè) N末端，和一個(gè)含有FAD和NADPH氧化酶結(jié)合位點(diǎn)的C末端區(qū)。域 II和V各有兩個(gè)組氨酸和亞鐵血紅素跨越他們。p22phox在 C端有一個(gè)脯氨酸富集區(qū)域（proline rich region，PRR）［14］。Rac1將細(xì)胞質(zhì)中的 p67phox· p40phox·p47phox復(fù)合物轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上的Nox2 ·p22phox復(fù)合物。當(dāng)這6種蛋白質(zhì)相互作用形成復(fù)合物時(shí)，它能將一個(gè)電子從 NADPH，黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）轉(zhuǎn)移到亞血紅素，最后與氧結(jié)合產(chǎn)生活性氧。NADPH氧化酶的組裝涉及到以下三種機(jī)制：（1）在P47phox未激活時(shí)，2個(gè)SRC同源區(qū)域（SRC homology domain，SH3）和自抑制區(qū)域（autoinhibitory region，AIR）結(jié)合導(dǎo)致 SH3被抑制。AIR發(fā)生磷酸化后會(huì)發(fā)生構(gòu)想變化，然后 P47phox可以和p22phox以及磷酸酰肌醇-3，4-磷酸氫鹽［Phosphatidylinositol-3，4-biphosphate，PI（3，4）P2］，磷脂酸（Phosphatidic acid，PA）結(jié)合到一起；（2）Rac1與GTP結(jié)合后可以從鳥嘌呤解離抑制劑（guanine dissociation inhibitor，GID）上被解離下來，然后與 Nox2以及p67phox相互作用；（3）肽重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域（tetratricopeptide repeat，TPR）通過Nox2和 p67phox上的 SH3相互作用。在以上三種機(jī)制的作用下，完成了 NADPH氧化酶的組裝［13］。

3 內(nèi)皮源性一氧化氮合酶

內(nèi)皮源性一氧化氮合酶（endothelial NO synthase，eNOS）是生成 NO的限速酶。作為內(nèi)皮源性血管舒張因子，eNOS衍生的一氧化氮（NO）在維持血管穩(wěn)態(tài)以及預(yù)防血管病變中起著至關(guān)重要的作用。eNOS在正常生理?xiàng)l件下即有表達(dá)，內(nèi)皮細(xì)胞可合成、釋放NO，激活血管平滑肌內(nèi)的鳥苷酸環(huán)化酶 ，使cGMP濃度升高，游離鈣離子的濃度降低，血管舒張。正常情況下，內(nèi)皮細(xì)胞不斷合成并釋放NO到血液和血管平滑肌中，使外周阻力血管維持正常舒張狀態(tài)，穩(wěn)定血壓。當(dāng)各種因素引起內(nèi)皮細(xì)胞受損，NO合成與釋放發(fā)生障礙，內(nèi)皮依賴性血管擴(kuò)張能力減弱，即可引起血壓升高。在高血壓病的患者，由于內(nèi)皮細(xì)胞 eNOS活性降低，NO合成減少，反過來又加速了高血壓的發(fā)生和發(fā)展［15］。

4 Rac1和 NADPH氧化酶的關(guān)系

Rac1的一個(gè)重要作用就是激活NADPH氧化酶產(chǎn)生活性氧（ROS）。Rac1在非造血細(xì)胞中表達(dá)，它還可能是 Nox1，Nox3，Nox4，Nox5的催化劑。血管內(nèi)皮細(xì)胞在激動(dòng)劑如血管緊張素Ⅱ刺激下，或暴露在高氧下，會(huì)導(dǎo)致 PLD1／PLD2（phospholipase D1／phospholipase D2）活化并產(chǎn)生磷脂酸（phosphatidic acid，PA）。PA調(diào)節(jié) Rac1／T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)因子 1（Tiam1）的活化，酪氨酸依賴性磷酸化p47phox和皮層蛋白，在脂微區(qū)進(jìn)行的復(fù)合物的組裝從而產(chǎn)生 ROS。NADPH氧化酶產(chǎn)生的 ROS改變了內(nèi)皮細(xì)胞的諸多功能，比如滲透率、增殖、遷移［16］。脂筏是膽固醇和鞘脂類富集微區(qū)，它是信號(hào)蛋白裝配和劃分的平臺(tái)。用激動(dòng)劑刺激血管細(xì)胞或?qū)⒓?xì)胞暴露在高氧下，會(huì)促進(jìn)Nox亞型的補(bǔ)充，如p47phox，p67phox，p22phox，Rac1，并促進(jìn)細(xì)胞骨架蛋白（如皮層蛋白和肌球蛋白輕鏈激酶）進(jìn)入脂筏。皮層蛋白和肌球蛋白輕鏈激酶作為支架蛋白會(huì)將 Rac1和 NADPH氧化酶轉(zhuǎn)移到到脂筏豐富的微囊蛋白-1區(qū)域，從而刺激 ROS的產(chǎn)生以及和 ROS相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞功能［16］。

5 Rac1和 eNOS的關(guān)系

他汀類藥物以及羥甲基戊二酰輔酶 A還原酶抑制劑，可以作用于 RhoA增加 NO的產(chǎn)生，同時(shí)通過作用于 Rac1減少 Nox依賴型O-2的產(chǎn)生［17-18］。由此可見，Rho家族的小 G蛋白和 eNOS之間存在一個(gè)潛在的鏈接。Ma等［19］最近的一份報(bào)道表明，Rac1不僅與 eNOS相互作用而且調(diào)節(jié) eNOS活性，這進(jìn)一步證實(shí)了 Rac1可以直接調(diào)節(jié) eNOS的功能的假說。此外，Rac1還參與了 eNOS mRNA的表達(dá)和穩(wěn)定，eNOS酶活性的表達(dá)，血管內(nèi)皮細(xì)胞 NO的產(chǎn)生［20］。有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，內(nèi)皮 Rac1是內(nèi)皮依賴性血管舒縮反應(yīng)和缺血誘導(dǎo)的血管生成所必不可少。Rac1蛋白主要是通過多種機(jī)制上調(diào) eNOS水平對(duì)血管內(nèi)皮功能產(chǎn)生影響。內(nèi)皮 NO合酶（eNOS）是內(nèi)皮衍生 NO的主要來源。該 eNOS的穩(wěn)態(tài) mRNA水平是 eNOS表達(dá)和激活以及提高 NO生物利用度的主要決定因素之一［21］。許多外源性刺激和條件，通過轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后機(jī)制改變 eNOS mRNA的水平。例如，eNOS表達(dá)的上調(diào)是由層流，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β和溶血磷脂酰膽堿介導(dǎo)。表達(dá)的下調(diào)是由腫瘤壞死因子-α和氧化低密度脂蛋白介導(dǎo)。2eNOS的酶活性由多種翻譯后機(jī)制進(jìn)一步調(diào)節(jié)，涉及蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)，磷酸化 eNOS，并通過 L-精氨酸攝取陽(yáng)離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋 白-1（cationicamino acid transporter-1，CAT-1）［22-23］。Rho GTP酶中的小GTP結(jié)合蛋白參與多功能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并由細(xì)胞外體液和機(jī)械刺激激活。它們介導(dǎo)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重排，基因表達(dá)，細(xì)胞周期進(jìn)程，以及其他許多重要的細(xì)胞功能［24］。Rho GTP酶家族中的兩個(gè)成員，RhoA和Rac1，已顯示出調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能的作用，例如極化，滲透性好等［25-26］。值得注意的是，抑制RhoA蛋白和它的效應(yīng)白細(xì)胞 Rho激酶能夠穩(wěn)定和上調(diào) eNOS mRNA的表達(dá)和改善血管內(nèi)皮功能［27-28］。然而，多數(shù)人并未發(fā)現(xiàn) Rac1在調(diào)節(jié) eNOS的表達(dá)和活性這方面的作用。流體剪切應(yīng)力和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子激活內(nèi)皮Rac1后，再通過 p21基因活化激酶（PAK）來介導(dǎo)其對(duì)細(xì)胞骨架重排和運(yùn)動(dòng)的影響。這兩個(gè)刺激在上調(diào)和激活 eNOS后，eNOS衍生的 NO便開始發(fā)揮其擴(kuò)張血管和促進(jìn)血管生成的作用。此外，Rac1和eNOS對(duì)于內(nèi)皮的運(yùn)動(dòng)，增殖，存活等均至關(guān)重要。這些結(jié)果表明，Rac1和 eNOS在調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能之間存在一定的聯(lián)系。

6 Rac1和 NADPH氧化酶以及 eNOS的關(guān)系

Hamamura等［20］首次研究了 Rac1單倍劑量不足對(duì)血管內(nèi)皮功能障礙的影響。因?yàn)?Rac1的基因缺失會(huì)導(dǎo)致胚胎致死，所以一直難以衡量 Rac1的缺乏會(huì)如何影響血管內(nèi)皮功能。而 Rac1單倍劑量不足小鼠模型清楚地表明，Rac1表達(dá)的減少導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，作為衡量的標(biāo)準(zhǔn)有內(nèi)皮依賴性血管舒張功能受損和延緩血管生成。第二，這項(xiàng)研究另一個(gè)最新的報(bào)道表明，Rac1作為NOS和 Nox的一個(gè)共同的控制元件，協(xié)調(diào)參與了內(nèi)皮細(xì)胞中 NO和 O2-產(chǎn)生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Rac1對(duì)NOS和Nox的作用機(jī)制是通過生長(zhǎng)因子或剪切壓力作用于內(nèi)皮細(xì)胞，激活NADPH氧化酶類（Noxs）和內(nèi)皮源性一氧化氮合酶（eNOS），他們分別負(fù)責(zé)產(chǎn)生 O2-和 NO［29-30］。有 研究證明Rac1可調(diào)控eNOS提高NO的生物利用度，維持內(nèi)皮系統(tǒng)功能的穩(wěn)定。O2-產(chǎn)生的增多，并不是直接通過調(diào)節(jié) eNOS而產(chǎn)生的。假設(shè)O2-和 NO的產(chǎn)生之間存在一種互斥機(jī)制，O2-與 NO形成反應(yīng)活躍的硝酸過氧化化合物（peroxynitrite，OONO-），則會(huì)使得 Rac1激活的 NO生物利用度降低，導(dǎo)致內(nèi)皮系統(tǒng)功能障礙［31］。Rac1對(duì) Nox和 eNOS的綜合調(diào)節(jié)效應(yīng)改變了 NO的生物利用度，從而影響血管內(nèi)皮功能?；?Rac1對(duì) eNOS水平和功能積極的調(diào)節(jié)作用，Hamamura等［20］推測(cè)，在預(yù)防內(nèi)皮功能障礙時(shí)Rac1可能是一個(gè)重要的治療靶點(diǎn)。事實(shí)上，Rac1的激活歷來認(rèn)為是許多炎癥反應(yīng)的重要組成部分，它在白細(xì)胞的遷移，黏附，趨化中扮演一個(gè)重要角色。

7 小結(jié)

Rac1作為eNOS和 Nox的一個(gè)共同的控制元件，協(xié)調(diào)參與了內(nèi)皮細(xì)胞中 NO和O-2產(chǎn)生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并影響血管內(nèi)皮功能。Rac1表達(dá)的減少會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，內(nèi)皮依賴性的血管擴(kuò)張受損，輕度高血壓和血管生成遲緩，這些都和 NO缺乏的癥狀相吻合。若闡明 Rac1調(diào)控 Nox和 eNOS水平和功能的精確機(jī)制，會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)高度選擇性靶向治療研究進(jìn)展的不斷深入。

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Research advances in the regulation of NADPH oxidase and eNOS by Rac1

LAN Chao-zong1，GAO Shan2
（1.Anhui University of Chinese Traditional Medicine，Hefei，Anhui 230031，China；2.Department of Pharmacology，Anhui Medical University，Hefei，Anhui 230032，China）

GTP binding protein，or G protein，is an important transduction molecule mediating extracellular signal transducting from membrane receptors into intracellular.Moreover，G protein is involved in many signal transduction pathways in vivo.The molecular weight of low molecular weight G protein is 2.0×104～3.0×104，equivalent to 1／4 to 1／3 of G protein，so it is called small G protein.Small G protein is a single chain structure，and possesses two main characteristics：GTP activity and binding with GTP or GDP.Rho is an important member of the small GTPases family，and it is the first Ras homologue to be discovered.Rac1 is a member of the Rho family，which regulates endothelial NO synthase（eNOS）and NADPH oxidases（Nox），and is responsible for production of O2-and NO，respectively.

Rac1；NADPH oxidases；endothelial endothelial NO synthase；comprehensive regulation

10.3969／j.issn.1009-6469.2014.08.001

2014-04-04，

2014-04-24）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 81073088，No 81373774）

蘭潮棕，男，碩士研究生

高 杉，男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：心血管藥理學(xué)，E-mail：aydgs＠126.com