高效液相色譜法測(cè)定人血漿中5-Fu濃度

俞 敏，王世亮，王小董，陳蒙蒙

（1.合肥工業(yè)大學(xué)控藥物研究室，安徽 合肥 230009；2.安徽中人科技有限責(zé)任公司 安徽 合肥 230061）

高效液相色譜法測(cè)定人血漿中5-Fu濃度

俞 敏1，2，王世亮1，王小董2，陳蒙蒙2

（1.合肥工業(yè)大學(xué)控藥物研究室，安徽 合肥 230009；2.安徽中人科技有限責(zé)任公司 安徽 合肥 230061）

目的 建立測(cè)定人血漿中5-氟尿嘧啶（5-Fu）濃度的方法。方法 以5-溴尿嘧啶（5-Bru）為內(nèi)標(biāo)，硫酸銨為蛋白沉淀劑，血漿采用乙酸乙酯提取處理后以高效液相色譜法進(jìn)樣測(cè)定，其中，色譜柱為 Hypersil ODS2（5 μm，4.6 mm×250 mm），流動(dòng)相為甲醇∶水（5∶95，V／V）溶液，流速0.8 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為266 nm，柱溫為25℃。結(jié)果 在0.020～0.250 mg·L-1濃度范圍內(nèi)藥物濃度與響應(yīng)值之間線性關(guān)系良（r＝0.999 6），最低定量限濃度為0.020 mg·L-1，日內(nèi)和日間 RSD分別為 2.97%～11.17%、1.67%～5.47%；高、中、低濃度的方法回收率均高于96%，高、中、低濃度的提取回收率均高于70%。血漿樣品在室溫24 h內(nèi)及冷凍條件下20 d內(nèi)穩(wěn)定性良好。結(jié)論 該方法具有操作簡(jiǎn)便可靠、準(zhǔn)確、穩(wěn)定性高等特點(diǎn)，適用于氟尿嘧啶植入劑人血漿中5-Fu濃度的測(cè)定。

氟尿嘧啶植入劑；血藥濃度；高效液相色譜法

中人氟安，氟尿嘧啶植入劑，是長(zhǎng)效緩釋抗腫瘤新制劑，為區(qū)域性化療藥物。其活性成分為氟尿嘧啶，臨床上經(jīng)皮穿刺、術(shù)中給藥、內(nèi)窺鏡下給藥三種給藥方式，藥物直接達(dá)到腫瘤局部區(qū)域。由于其獨(dú)特的給藥方法，可實(shí)現(xiàn)局部區(qū)域的腫瘤靶向治療，局部藥物濃度高，血藥濃度極低。鑒于該植入劑的給藥特點(diǎn)（主要是血藥濃度低），有必要建立測(cè)定人體血漿中5-氟尿嘧啶（5-Fu）低濃度的靈敏方法，用于植入劑在人體內(nèi)釋藥特性、藥動(dòng)學(xué)、藥效學(xué)等研究［1］。已有文獻(xiàn)報(bào)道用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定5-Fu濃度，但方法往往檢測(cè)限過(guò)高或者難以重復(fù)［2-4］。本試驗(yàn)旨在建立一種靈敏、準(zhǔn)確、快速的測(cè)定人體血漿內(nèi)5-Fu血藥濃度的方法［5-7］。

1 儀器與試藥及試劑

1.1 儀器 高效液相色譜系統(tǒng)，包括 LC-10ATVP雙泵、SPD-10AVP可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器、CBM-10A系統(tǒng)控制器、LC solution工作站（日本島津公司）氮?dú)獯蹈蓛x（HP5016SY TERMOVAP SAMPLE COVCENTRATOR）（SHANGHAI EASTSEN ANALYTICAL INSTRUMENT Co.LTD）。

1.2 試藥及試劑 氟尿嘧啶對(duì)照品，中國(guó)藥品質(zhì)量檢驗(yàn)所提供，批號(hào)：100187-200602；溴尿嘧啶對(duì)照品（內(nèi)標(biāo)物），純度：99%，美國(guó)Sigma公司提供；其他試劑：甲醇為色譜純，乙酸乙酯和硫酸銨為分析純。各種溶液的配制均使用重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil ODS2色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相：甲醇—水（5∶95，V／V），流速：0.8 mL·min-1；紫外分光光度測(cè)定波長(zhǎng)：266 nm；柱溫：25℃。進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 氟尿嘧啶（5-Fu）對(duì)照液配制 取氟尿嘧啶對(duì)照品約20 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，得儲(chǔ)備液（200 mg·L-1）。精密量取儲(chǔ)備液2.0 mL，置200 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得（2 mg·L-1）。

2.3 溴尿嘧啶（5-Bru）內(nèi)標(biāo)溶液配制 稱取溴尿嘧啶50 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇適量（約10 mL）使溶解，加水稀釋至刻度，搖勻，得儲(chǔ)備液（500 mg·L-1）。精密量取儲(chǔ)備液2.0 mL，置200 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得（5 mg·L-1）。

2.4 中人氟安植入劑臨床植入及采樣方法 接受中人氟安植入劑應(yīng)用的臨床適應(yīng)證患者，通過(guò)植藥器械將藥物直接植入靶部位，按預(yù)定的藥代采樣時(shí)間點(diǎn)采靜脈血，肝素抗凝管，3 mL。采后靜置 1 h后，以2 000 r·min-1離心分離血漿。

2.5 空白血漿處理方法 沉淀蛋白：取血漿樣品0.50 mL，置10 mL具塞試管中，加水0.20 mL，渦旋混勻，加入硫酸銨0.2 g，密塞，渦旋混勻。提?。杭尤胍宜嵋阴? mL，密塞，渦旋5 min，離心（3 000 r ·min-1）10 min，分取上清液，置氮吹儀下吹干；在上述殘留血漿中，再加入乙酸乙酯 4 mL，渦旋 5 min，離心（3 000 r·min-1）10 min，分取上清液，并入上述離心管中；濃縮：再將離心管置氮吹儀下吹干，向離心管中加入乙酸乙酯1 mL，密封膜封口，渦旋3 min，洗滌上部管壁，去掉封口膜，再將離心管置氮吹儀下吹干；重組：向離心管中精密加入流動(dòng)相100 μL，密封膜封口，渦旋5 min，超聲10 min，溶液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。取供試品溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

2.6 血漿樣品處理方法 取血漿樣品0.50 mL，置10 mL具塞試管中，加入水0.10 mL，內(nèi)標(biāo)物5-Bru溶液（約50 mg·L-1）100 μL，渦旋混勻，加入硫酸銨0.2 g，密塞，渦旋混勻。其他同2.5提取、濃縮及重組項(xiàng)下依法操作。

2.7 專屬性考察 取空白血漿 0.50 mL按“2.5”項(xiàng)下操作，取濾液20 μL注入液相色譜儀，得空白血漿色譜圖，判斷空白血漿色譜圖干擾情況；取5-Fu對(duì)照品和5-Bru內(nèi)標(biāo)液混合，取20 μL注入色譜儀，得5-Fu對(duì)照品 +5-Bru內(nèi)標(biāo)液色譜圖；將空白血漿和5-Fu對(duì)照品及5-Bru內(nèi)標(biāo)液混合，按“2.6［將加入水100 μL改為加5-Fu對(duì)照溶液（2 mg·L-1）100 μL］”項(xiàng)下方法操作，取濾液 20 μL注入液相色譜儀，得空白血漿 +5-Fu對(duì)照品 +5-Bru內(nèi)標(biāo)液色譜圖。高效液相色譜圖見(jiàn)圖1。

2.8 線性關(guān)系考察 分別精密量取氟尿嘧啶對(duì)照品溶液5、10、20、30、40、50、60 μL，分別置10 mL具塞試管中，各精密加入溴尿嘧啶內(nèi)標(biāo)溶液30 μL，再分別精密加水使成100 μL（65、60、50、40、30、20、10 μL），各管中再分別精密加入空白血漿0.50 mL，渦旋混勻，靜置10 min，再分別加硫酸銨 0.2 g，密塞，渦旋混勻。將上述內(nèi)容列表，見(jiàn)表1。

2.9 精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn) 配制低、中、高（0.021、0.124、0.206 mg·L-1）三種含5-Fu濃度不同的血漿樣，每種濃度 6份，按“2.5”項(xiàng)下方法處理，與同日內(nèi)和連續(xù) 5日分別處理測(cè)定。將測(cè)得的5-Fu峰高／5-Bru峰高的比值代入當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得相應(yīng)濃度，計(jì)算 RSD；將計(jì)算濃度與理論濃度相比，求得方法回收率，詳見(jiàn)表2。

圖 1 高效液相色譜圖（1.氟尿嘧啶；2.溴尿嘧啶）

2.10 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn) （1）室溫保存：在室溫（25 ±2）℃條件下考察24 h與 48 h試樣的穩(wěn)定性（以方法回收率表示）：24 h為100.5%，48 h為73.5%。顯見(jiàn)在室溫（25±2）℃條件下24 h內(nèi)變異較小，故建議樣品室溫的保存期以24 h以內(nèi)。

（2）冰凍保存：在 -20℃冰凍條件下考察 10 d 與20 d的穩(wěn)定性（以方法回收率表示）：10 d為99.9%，20 d為98.9%。相對(duì)變異CV均小于5%。顯示在-20℃冰凍條件下保存 20 d內(nèi)都是基本穩(wěn)定的。

此外，按中檢所建議，5-Fu生物樣品，不適合反復(fù)凍融。故未做兩次及以上反復(fù)凍融的試驗(yàn)。

2.11 提取回收率試驗(yàn) 配制低、中、高（0.021、0.124、0.206 mg·L-1）三種含 5-Fu濃度不同的血漿樣，每種濃度 6份，按“2.5”項(xiàng)下方法處理，與同日內(nèi)分別處理測(cè)定。將測(cè)得的 5-Fu峰高／5-Bru峰高的比值代入當(dāng)日用流動(dòng)相配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得相應(yīng)濃度，計(jì)算 RSD；將計(jì)算所得血漿中的 5-Fu濃度與理論濃度相比，求得提取回收率，詳見(jiàn)表3。

以上各管分別照“2.5”項(xiàng)下自“加乙酸乙酯 4 mL”開(kāi)始，依法操作，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線系列濃度色譜圖。經(jīng)譜圖處理分析得到5-Fu峰高與 5-Bru峰高比值（X），以5-Fu峰高與5-Bru峰高比值（X）對(duì)相應(yīng)濃度（C）進(jìn)行回歸分析，得回歸方程為：C＝0.141 3X-0.008 5（r＝0.999 6，n＝7），標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見(jiàn)圖2。

結(jié)果表明：5-Fu血藥濃度在0.020～0.250 mg ·L-1范圍內(nèi)藥物濃度與響應(yīng)值之間呈良好的線性關(guān)系。

表1 5-Fu對(duì)照品溶液（2.060 mg·L-1）5-Bru內(nèi)標(biāo)溶液（5.160 mg·L-1）

表2 精密度與準(zhǔn)確度（回收率）試驗(yàn)結(jié)果

2.12 6例患者臨床生物樣檢測(cè)結(jié)果 數(shù)據(jù)見(jiàn)表4?；颊呔鶠橥砥谖赴?，均經(jīng)手術(shù)治療后，于術(shù)中給入中人氟安800 mg。關(guān)腹處理后于表4所列時(shí)間點(diǎn)，采集靜脈血，肝素抗凝，于24 h內(nèi)按本法進(jìn)行HPLC測(cè)定。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表 3 提取回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

圖2 5-Fu血藥濃度與響應(yīng)值的關(guān)系曲線圖

3 討論

在試驗(yàn)過(guò)程中，筆者在蛋白沉淀劑硫酸銨的用量及流動(dòng)相選擇上都做了很多試驗(yàn)。在硫酸銨的用量上做了0.1、0.2、0.3 g三種量，最終發(fā)現(xiàn)小于0.2 g時(shí)蛋白沉淀不完全，在乙酸乙酯萃取時(shí)常發(fā)生乳化現(xiàn)象，0.2 g與0.3 g兩種用量對(duì)蛋白沉淀的效果相當(dāng)，故選擇了0.2 g硫酸銨沉淀0.5 mL的血漿樣品。在流動(dòng)相的選擇上采用水、乙腈和甲醇多種組份和多種比例作為流動(dòng)相，但發(fā)現(xiàn)甲醇—水（5 ∶95，V／V）對(duì)其分離效果較好，因此，最終選用甲醇—水（5∶95，V／V）為流動(dòng)相。對(duì)5-Fu掃描其最大吸收波長(zhǎng)為266 nm，且此波長(zhǎng)下5-Fu及5-Bru內(nèi)標(biāo)都有較好的分離效果，分離度均達(dá)到1.5以上。

總而言之，經(jīng)過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證［8］，該方法符合生物樣本測(cè)定的要求，試驗(yàn)過(guò)程中所用試劑成本低，適合大樣本研究中血漿中5-Fu濃度的測(cè)定。該方法具有操作簡(jiǎn)便可靠、準(zhǔn)確、穩(wěn)定性高等特點(diǎn)，用于人血漿中5-Fu的濃度測(cè)定。該方法的建立可以為5-Fu的人體藥動(dòng)學(xué)相關(guān)研究提供參考。

表 4 6例患者臨床生物樣檢測(cè)結(jié)果（mg·L-1）

［1］ 劉華頂，王世亮，俞 敏，等.氟尿嘧啶植入劑胃癌術(shù)后腹腔緩釋化療的藥動(dòng)學(xué)研究［J］.癌癥進(jìn)展，2012，10（1）：73-79.

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［3］ Licea-Perez H，Wang S，Bowen C.Development of a sensitive and selective LC-MS／MS method for the determination of alphafluorobeta-alanine，5-fluorouracil and capecitabine in human plasma ［J］.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2009，877 （11／12）：1040-1046.

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［8］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典（二部）［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄 XIX A.

Determination of fluorouracil implants concentration in human plasma by HPLC

YU Min1，2，WANG Shi-liang1，WANG Xiao-dong2，et al
（1.Controlled Releasing Drug Research Center，Hefei University of Technology，Hefei 230009，China；2.Anhui Zhongren Technology Co.Ltd.，Hefei 230061，China）

Objective To develop a method for the determination of 5-fluorouracil concentration in human plasma.Methods 5-Bromouracil was used as the internal standard，ammonium sulfate was added to precipitate protein，plasma sample was treated with extraction of ethyl acetate，and then HPLC method was adopted for concentration determination.The determination was performed on Hypersil ODS2（5 μm，4.6 mm×250 mm）column with mobile phase consisting of methyl alcohol-water（5∶95，v／v）at the flow rate of 0.8 mL ·min-1.The detection wavelength was set at 266 nm and column temperature was 25℃.Results The linear range of 5-fluorouracil was 0.020～0.250 mg·L-1（r＝0.999 6）.The lowest limit of quantification was 0.020 mg·L-1.The RSD of intra-day and inter-day were 2.97%～11.17%and 1.67%～5.47%respectively.The recovery rates were all higher than 96%at high，medium and low concentrations.The extraction rates were all higher than 70%at high，medium and low concentrations.The plasma samples were stable within 24 hours at room temperature and within 20 days in frozen condition.Conclusions This method is simple，precise and stable，which is suitable for the determination of 5-fluorouracil concentration in human plasma.

fluorouracil implants；plasma concentration；HPLC

10.3969／j.issn.1009-6469.2014.08.009

2013-11-10，

2014-03-09）

安徽省十五科技攻關(guān)重點(diǎn)項(xiàng)目（No 01013036）

王世亮，男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：植入劑藥學(xué)，E-mail：WSL290＠126.com