小檗堿對(duì)葛根素在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的影響

吳 恒，陳禮明

（1.安徽省蚌埠市第三人民醫(yī)院藥學(xué)部，安徽 蚌埠 233000；2.安徽省立醫(yī)院藥劑科，安徽 合肥 230001）

小檗堿對(duì)葛根素在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的影響

吳 恒1，陳禮明2

（1.安徽省蚌埠市第三人民醫(yī)院藥學(xué)部，安徽 蚌埠 233000；2.安徽省立醫(yī)院藥劑科，安徽 合肥 230001）

目的 觀察小檗堿對(duì)葛根素在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的影響。方法 建立高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定大鼠血漿中葛根素的濃度。大鼠灌胃給予葛根素（100 mg·kg-1）及葛根素和小檗堿混合物（100 mg·kg-1+50 mg·kg-1、100 mg·kg-1+100 mg ·kg-1、100 mg·kg-1+200 mg·kg-1），用HPLC法測(cè)定大鼠給藥后不同時(shí)間血漿葛根素的濃度，DAS ver1.0數(shù)據(jù)處理軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。結(jié)果 葛根素在0.10～10.00 mg·L-1范圍內(nèi)線性良好（r＝0.999 5）。合用小檗堿前后葛根素的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Cmax分別為（0.54±0.05）、（0.59±0.03）、（0.67±0.02）、（0.73±0.03）mg·L-1；AUC0～∞分別為（4.90±2.91）、（4.63 ±2.11）、（3.42±2.44）、（6.18±2.57）mg·L-1·h-1；CL分別為（26.92±16.24）、（25.94±13.36）、（44.58±30.36）、（18.82±8.47）L·h-1·kg-1。結(jié)論 高劑量小檗堿可提高葛根素在大鼠體內(nèi)的吸收。

葛根素；小檗堿；藥動(dòng)學(xué)

在中藥復(fù)方中，葛根常與黃連配伍，如葛根芩連煎劑［1］、連葛降糖片［2］、黃連散［3］等。葛根素是從豆科植物野葛 Puera ria lobata（Willd）Ohwi中提取的有效成分，有擴(kuò)張冠脈、增加冠脈血流量、降低血壓、減慢心率、降低心肌耗氧量、改善微循環(huán)、降血糖等作用［4-5］。臨床上用于心腦血管疾病、糖尿病并發(fā)癥、眼底病等多種疾病。小檗堿（berberine）是由黃連、黃柏、三棵針或其他含小檗堿的植物中提取的生物堿，臨床上一直作為清熱解毒、抗感染藥物。近些年來，發(fā)現(xiàn)其也可用于治療心血管、消化道、糖尿病等疾?。?］。

關(guān)于小檗堿對(duì)葛根素藥動(dòng)學(xué)特性影響的研究，有助于闡明這類中藥復(fù)方的配伍機(jī)制。但葛根素與小檗堿合用后是否會(huì)影響葛根素的藥動(dòng)學(xué)過程，國(guó)內(nèi)外尚未見研究報(bào)道。因此，本文采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定大鼠體內(nèi)的葛根素血藥濃度，探討兩藥合用后葛根素在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)變化情況。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Sprague-Dawley（SD）大鼠，雄性，體重（200±20）g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SYXK（皖）2011-007，試驗(yàn)前動(dòng)物禁食12 h。

1.2 儀器 島津高效液相色譜儀（LC-20AT泵，CBM-20Alite控制器，SPD-20A紫外檢測(cè)器，CTO-

10ASvp柱溫箱，LC-Solution Lite工作站）；XW-80A微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)（長(zhǎng)沙相儀離心機(jī)儀器有限公司）；Bp211D型電子天平（德國(guó) Sartorius公司）；KQ-500DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3 藥品與試劑 葛根素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào) 110752-200511）；葛根素（揚(yáng)子江藥 業(yè) 集 團(tuán) 有 限公司，批 號(hào) 20081106，含 量100.5%）；小檗堿（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院中藥制劑研究室提供，含量 ＞99%）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站）；高氯酸（上海桃浦化工廠）；甲醇（色譜純，天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司）；磷酸二氫鉀（分析純）；水為雙蒸水。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及血樣采集 SD大鼠20只，實(shí)驗(yàn)前12 h開始禁食不禁水，隨機(jī)分成四組，每組 5只，分別灌胃葛根素混懸液（100 mg·kg-1）及葛根素和小檗堿混合液（100 mg·kg-1+50 mg·kg-1、100 mg·kg-1+100 mg·kg-1、100 mg·kg-1+200 mg ·kg-1），于給藥前和給藥后 5，10，20，40 min，1，1.5，2，4，6，8 h眼眶取血，置肝素化試管中，15 000 r ·min-1離心 10 min，分離血漿，-20℃冰箱保存待測(cè)。

2.2 血漿樣品的處理 精密吸取血漿樣品0.1 mL置于離心管中，加入 6%高氯酸 0.1 mL沉淀蛋白，于渦旋混合器上混勻 5 min后，15 000 r·min-1離心10 min。取上清液20 μL進(jìn)樣。

2.3 血漿中葛根素 HPLC測(cè)定法

2.3.1 色譜條件 Hypersil ODS色譜柱（4.6 mm ×150 mm，5 μm），流動(dòng)相甲醇—0.004 3 mol·L-1磷酸二氫鉀緩沖液（pH調(diào)至2.7）（22∶78），流速0.8 mL·min-1，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm，進(jìn)樣量20 μL。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及最低檢測(cè)濃度測(cè)定 取空白血漿180 μL，加入不同濃度的葛根素對(duì)照品溶液，使葛根素血藥濃度依次為 0.10、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 mg·L-1，按血漿樣品處理方法操作，記錄色譜峰面積，以樣品峰面積 A對(duì)樣品質(zhì)量濃度 C作線性回歸。

2.3.3 方法回收率及精密度試驗(yàn) 配置葛根素濃度為0.25、1.00、5.00 mg·L-1的血漿樣品，按血漿樣品的處理操作，進(jìn)行色譜分析，將葛根素峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度，用測(cè)得濃度與配制濃度之比，求得方法回收率。取上述低、中、高3種濃度的葛根素血漿樣品，按血漿樣品的處理操作，進(jìn)行色譜分析，將葛根素峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得濃度，于同日內(nèi)和不同日處理測(cè)定5次，計(jì)算日內(nèi)和日間精密度。

2.4 數(shù)據(jù)分析 將實(shí)驗(yàn)所得的血藥濃度數(shù)據(jù)采用DAS ver1.0藥動(dòng)學(xué)計(jì)算軟件求算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，計(jì)量資料以（±s）表示，組間差異的比較采用成組 t檢驗(yàn)，P＜0.05視為有顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 葛根素血藥濃度測(cè)定的方法學(xué)驗(yàn)證

3.1.1 方法的專屬性 在本色譜條件下，血漿中雜質(zhì)不干擾樣品測(cè)定，葛根素峰形良好，結(jié)果見圖 1。

圖 1 葛根素血漿色譜圖（1.葛根素）

3.1.2 線性關(guān)系及最低檢測(cè)濃度 葛根素血藥濃度0.10～10.00 mg·L-1線性關(guān)系良好，回歸方程 A ＝2.701 9×104C+2 495.8，r＝0.999 5；葛根素的最低檢測(cè)濃度為0.05 mg·L-1（S／N≥3）。

3.1.3 方法回收率及精密度試驗(yàn) 見表 1。

3.2 葛根素藥—時(shí)曲線及藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

3.2.1 葛根素及小檗堿合用組藥—時(shí)曲線 見圖2。

3.2.2 藥動(dòng)學(xué)參數(shù) 見表2。

圖2 合用小檗堿前、后葛根素平均血藥濃度—時(shí)間曲線（n＝5）

表1 血漿中葛根素的回收率和精密度（±s，n＝5）

表1 血漿中葛根素的回收率和精密度（±s，n＝5）

加入量／mg·L-1回收率／% 平均回收率／%RSD／%日內(nèi) 日間0.25 96.64±0.0442.11 2.79 1.00 87.36±0.031 98.85±0.038 1.53 2.47 5.00 112.55±0.0381.9 2.38

表2 單用及合用小檗堿后葛根素的平均藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n＝5）

表2 單用及合用小檗堿后葛根素的平均藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n＝5）

注：與葛根素組比較*P＜0.01。

參數(shù) 葛根素 小檗堿50 mg·kg-1小檗堿100 mg·kg-1小檗堿200 mg·kg-11.75±1.40 1.30±1.00 0.85±0.54 1.56±0.62α／h-11.13±0.85 0.97±0.41 0.89±0.47 0.86±0.36 B／mg·L-10.21±0.08 0.28±0.14 0.57±0.56 0.52±0.36β／h-10.09±0.10 0.09±0.09 0.34±0.37 0.11±0.12 ka／h-12.58±1.14 3.07±1.44 4.27±3.07 2.43±1.68 t1／2ka／h 0.37±0.30 0.27±0.11 0.28±0.25 0.42±0.28 t1／2α／h 1.08±0.87 1.05±0.98 1.01±0.58 0.95±0.43 t1／2β／h 13.57±7.25 14.28±12.03 7.83±8.90 10.41±5.98 k10／h-10.21±0.11 0.20±0.06 0.42±0.35 0.20±0.10 k12／h-10.66±0.64 0.56±0.33 0.33±0.46 0.39±0.26 k21／h-10.35±0.21 0.30±0.09 0.48±0.31 0.38±0.18 AUC0～∞／mg·L-1·h-14.90±2.91 4.63±2.11 3.42±2.44 6.18±2.57 CL／L·h-1·kg-126.92±16.24 25.94±13.36 44.58±30.36 18.82±8.47 tmax／h 0.80±0.18 0.87±0.18 0.83±0.37 1.03±0.30 Cmax／mg·L-10.54±0.05 0.59±0.03 0.67±0.02*0.73±0.03 A／mg·L-1*

4 討論

葛根素為水不溶性，口服后難以被吸收，絕對(duì)生物利用度很低［7］。近年來提高葛根素生物利用度制劑研究較多：如葛根素微粉［8］，葛根素固體分散體［9］，葛根素磷脂復(fù)合物［7，10］，葛根素固體自微乳［11］，葛根素的衍生物［12］等，長(zhǎng)期以來，對(duì)葛根素的研究主要集中在對(duì)該藥的藥效研究領(lǐng)域，而對(duì)該藥與其他藥物的相互作用研究較少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，葛根素與小檗堿合用后，小檗堿（50 mg· kg-1）組藥動(dòng)學(xué)參數(shù)與葛根素組無顯著性差異，小檗堿（100、200 mg·kg-1）組 Cmax增大，有顯著性差異（P＜0.01），小檗堿（200 mg·kg-1）組 AUC增大，CL減少，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)可能原因如下。

葛根素是 P-糖蛋白的底物［13］，在Caco-2細(xì)胞模型中的轉(zhuǎn)運(yùn)受到P-糖蛋白的外排作用［14］。P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）是一種能量依賴性的藥物外運(yùn)泵，可減少藥物在腸道的吸收。而小檗堿可增加 P-gp底物在細(xì)胞中的濃度，推測(cè)小檗堿是P-gp的弱抑制劑［15］。另外小檗堿是P-gp底物［16-17］，如果其在腸腔的濃度較高，勢(shì)必也會(huì)使腸細(xì)胞膜上 P-gp的轉(zhuǎn)運(yùn)功能飽和。因此，我們推測(cè)小檗堿在大劑量時(shí)降低葛根素的代謝機(jī)制在于 P-gp功能的抑制和飽和。為了闡明小檗堿和葛根素相互作用的機(jī)制，需要做進(jìn)一步研究和證實(shí)。

中藥復(fù)方的藥動(dòng)學(xué)研究極為復(fù)雜，有研究提示，葛根素的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)可反映葛根黃酮的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)［18］，方劑有效成分的濃度與療效呈良好的相關(guān)性。本文以葛根素為檢測(cè)指標(biāo)，研究葛根素在動(dòng)物體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)過程，有助開展中藥復(fù)方中主要有效成分間的配伍研究，探討中藥復(fù)方內(nèi)在配伍規(guī)律（組分合和），逐步建立中藥復(fù)方配伍的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化。

人們對(duì)葛根素的藥動(dòng)學(xué)雖有所研究，隨著新的復(fù)方制劑的不斷出現(xiàn)，尚需要進(jìn)一步進(jìn)行系統(tǒng)深入地探討。還應(yīng)加強(qiáng)研究不同部位、不同劑型、不同劑量葛根素在動(dòng)物體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)處置的關(guān)系，并將藥動(dòng)學(xué)研究與藥效學(xué)研究結(jié)合起來，以更好地說明藥物在體內(nèi)的規(guī)律，為臨床合理用藥提供較為全面的理論依據(jù)。此外，還要深入研究不同藥物配伍對(duì)葛根素藥動(dòng)學(xué)的影響，加強(qiáng)證治藥動(dòng)學(xué)的研究。近來研究發(fā)現(xiàn)，不同“證”，體內(nèi)同一藥物的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)差異顯著，這種差異將影響到藥物的療效及毒副作用，通過辨證施治可減少或消除這種差異。機(jī)體的不同疾病狀態(tài)對(duì)藥物在體內(nèi)代謝的影響已普遍引起人們的重視，“證”與葛根素藥動(dòng)學(xué)的相互作用及其機(jī)制的研究報(bào)道較少。相信隨著中醫(yī)藥的現(xiàn)代化發(fā)展，一些新理論和方法學(xué)的提出，如“證治藥動(dòng)學(xué)”假說、“復(fù)方效應(yīng)成分藥動(dòng)學(xué)”假說、“血清藥理學(xué)”方法，通過單體—復(fù)方整體—藥效學(xué)（PKPD）模型研究這種螺旋式辨證發(fā)展過程，相信中藥藥代動(dòng)力學(xué)的發(fā)展會(huì)有個(gè)更大地飛躍。

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Effect of berberine on pharmacokinetics of puerarin in rats

WU Heng1，CHEN Li-ming2
（1.Department of Pharmacy，The Third People’s Hospital，Bengbu，Anhui 233000，China；2.Department of Pharmacy，Anhui Province Hospital，Anhui 230001，China）

Objective To observe the effect of berberine on pharmacokinetics of puerarin in rats.Methods Plasma puerarin concentration was determined by HPLC after intragastrical administration of puerarin（100 mg·kg-1）or puerarin combined with berberine （50，100，200mg·kg-1）in rats.The data were processed by DAS ver1.0 software to calculate the pharmacokinetic parameters.Results Chromatographic peaks for puerarin were separated well by the HPLC method.Regression analysis of the data of puerarin concentration against its peak area showed a good straight line in the range of 0.10～10.00 mg·L-1（r＝0.999 5）.The main pharmacokinetic parameters of puerarin before and after coadministration of berberine were as follows：Cmaxwere（0.54±0.05），（0.59±0.03），（0.67±0.02），（0.73±0.03）mg·L-1；AUC0～∞were（4.90±2.91），（4.63±2.11），（3.42±2.44），（6.18±2.57）mg·L-1·h-1；CL were（26.92±16.24），（25.94±13.36），（44.58±30.36），（18.82±8.47）L·h-1·kg-1.Conclusions High dose of berberine can significantly enhance puerarin absorption in rats.

puerarin；berberine；pharmacokinetics

10.3969／j.issn.1009-6469.2014.08.005

2014-02-24）

陳禮明，男，主任藥師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中藥臨床藥劑學(xué)，E-mail：ysh10506＠yahoo.com.cn