大腸埃希菌生物膜在三種導(dǎo)尿材料上形成的對(duì)比方

芳畢等

【摘要】 目的：觀察不同材質(zhì)導(dǎo)尿管對(duì)大腸埃希菌生物膜形成的影響。方法：在乳膠、純硅膠、硅橡膠材質(zhì)導(dǎo)尿管膜片上制備大腸埃希菌生物膜，掃描電鏡觀察生物膜的形態(tài)。用沖洗、沖洗+超聲振蕩方法處理附有不同生長(zhǎng)時(shí)期生物膜的導(dǎo)尿管，通過菌落計(jì)數(shù)法了解兩種方法對(duì)不同時(shí)期生物膜的清除效應(yīng)。結(jié)果：乳膠、純硅膠、硅橡膠導(dǎo)尿管生物膜內(nèi)均有細(xì)菌團(tuán)塊樣聚集，可見纖維素樣物質(zhì)交聯(lián)。硅橡膠導(dǎo)尿管生物膜內(nèi)纖維素樣交聯(lián)物相對(duì)較少。在生物膜形成的初期，兩種處理方法具有相同清除效應(yīng)；但當(dāng)生物膜趨于成熟后，單用沖洗方法難以將黏附細(xì)菌洗脫。結(jié)論：建議選擇使用經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的硅橡膠導(dǎo)尿管。在生物膜形成初期，對(duì)導(dǎo)尿管一般沖洗能較徹底地清除黏附細(xì)菌。

【關(guān)鍵詞】 導(dǎo)尿管； 大腸埃希菌； 生物膜； 掃描電鏡

留置導(dǎo)尿是臨床常用的一種操作技術(shù)，導(dǎo)尿管伴隨尿道感染（Catheter-associated urinary tract infection，CAUTI）是留置導(dǎo)尿引起的一種常見的醫(yī)院感染。盡管采取無菌操作等措施，仍然有1/3導(dǎo)尿管伴隨尿路感染無法控制。導(dǎo)尿管的生物材料等因素與泌尿系統(tǒng)感染有直接關(guān)系。筆者對(duì)比不同材質(zhì)導(dǎo)尿管生物膜形成的過程，為臨床合理選擇導(dǎo)尿管提供客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 導(dǎo)尿管種類 純硅膠導(dǎo)尿管（廣州市香雪生物醫(yī)學(xué)工程有限公司）、乳膠導(dǎo)尿管（廣州市韋士泰醫(yī)療器械有限公司）、硅橡膠導(dǎo)尿管（秦皇島市旭明醫(yī)用硅橡膠制品有限公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株 大腸埃希菌菌株：沈陽醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室提供（經(jīng)ATB生化鑒定）。

1.3 生物膜的制備 將三種材料的導(dǎo)尿管用打孔器制備成直徑為0.7 cm圓片，高壓蒸汽滅菌后分別放入含有2 mL/孔MH肉湯的12孔培養(yǎng)板，每孔加入0.5比濁的大腸埃希菌菌液50 ?L，置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24小時(shí)更換培養(yǎng)液一次，共培養(yǎng)3 d。

1.4 掃描電鏡觀察 取出培養(yǎng)18、24、48、72 h導(dǎo)尿管膜片，用無菌生理鹽水沖洗，洗掉浮游細(xì)菌，至2.5%戊二醛溶液中4 ℃固定2 h，以pH 7.2的磷酸緩沖液沖洗3次，20 min/次，再以1%鋨酸4 ℃固定2 h，4 ℃磷酸緩沖液沖洗3次，20 min/次，梯度乙醇脫水，醋酸異戊酯置換，CO2臨界點(diǎn)干燥，離子噴金鍍膜，通過SEM進(jìn)行觀察。

1.5 處理生物膜 分別在孵育18、24、48、72 h各取出6塊膜片，分成兩組，每組3片，分別用以下兩種方法處理：（1）用0.9%NS 2mL沖洗5次，收集洗脫液于20 mL無菌離心管里。（2）用0.9%NS 2 mL沖洗4次，置于含2 mL 0.9%NS的無菌試管中，超聲震蕩120 W，15 min，收集所有洗脫液（6 mL）于20 mL無菌離心管里。將以上兩種方法所得洗脫液吸取0.1 mL，倍比稀釋至10萬倍，取出0.1 mL稀釋液注入無菌平皿中，加入高壓蒸汽滅菌后冷卻至40 ℃左右的營(yíng)養(yǎng)瓊脂中混勻，置于37 ℃生化培養(yǎng)箱，孵育24 h，用全自動(dòng)菌落分析儀（杭州迅數(shù)科技有限公司，型號(hào)HR2）計(jì)數(shù)細(xì)菌培養(yǎng)基上菌落數(shù)量。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行三次。

1.6 菌落計(jì)數(shù)的換算 按以下公式算出實(shí)際菌落數(shù)。實(shí)際菌落數(shù)（CFU/cm3）=肉眼可計(jì)菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)/膜片體積，取實(shí)際菌落數(shù)的常用對(duì)數(shù)（lgCFU/cm3）為標(biāo)準(zhǔn)菌落計(jì)數(shù)單位。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 菌落計(jì)數(shù)換算為標(biāo)準(zhǔn)菌落計(jì)數(shù)單位，采用SAS 8.1軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)或方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 掃描電鏡觀察 大腸埃希菌在純硅膠、乳膠、硅橡膠三種材質(zhì)表面孵育早期（18～24 h），無明顯細(xì)菌生物膜形成。培養(yǎng)48 h后，細(xì)菌生物膜形成。硅橡膠導(dǎo)尿管表面細(xì)菌生物膜形成較晚且生物膜內(nèi)細(xì)菌數(shù)量相對(duì)較少，見圖1。

2.2 菌落計(jì)數(shù)比較 大腸埃希菌在純硅膠、乳膠、硅橡膠三種材質(zhì)表面孵育早期（18～24 h），沖洗和沖洗+振蕩兩種處理方法的生物膜內(nèi)細(xì)菌的菌落計(jì)數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），且經(jīng)過沖洗+振蕩處理后三種材質(zhì)間的對(duì)數(shù)菌落計(jì)算的比較差異也均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.03，P=0.9584；F=3.56，P=0.0923）。而在生物膜形成的后期48 h和72 h時(shí)，沖洗和沖洗+振蕩兩種處理方法的生物膜內(nèi)細(xì)菌的菌落計(jì)數(shù)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），三種材質(zhì)間的對(duì)數(shù)菌落計(jì)算的比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=16.77，P=0.0015；F=89.21，P=0.0001），見表1。

3 討論

細(xì)菌生物膜（bacteria biofilm，BBF）是附著于惰性或者活性實(shí)體表面的細(xì)菌細(xì)胞和包裹著細(xì)菌的細(xì)菌自身所分泌的含水聚合性基質(zhì)組成的結(jié)構(gòu)性細(xì)菌群落。細(xì)菌生物膜內(nèi)的細(xì)菌具有傳染性和致病性，是醫(yī)院感染最主要的原因[1-2]。研究認(rèn)為超過60%的感染是由細(xì)菌生物膜引起的[3]。細(xì)菌能黏附幾乎所有醫(yī)療器械的材料表面形成生物膜，其中以中心靜脈導(dǎo)管、導(dǎo)尿管更為常見[4-5]。細(xì)菌生物膜是導(dǎo)尿管伴隨尿路感染的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。

導(dǎo)尿管伴隨尿路感染可由多種微生物引起，在眾多病原體中，大腸埃希菌的檢出率為最高[6]。筆者以臨床較常使用的三種材質(zhì)的導(dǎo)尿管為載體，在大腸埃希菌細(xì)菌懸液中體外分別孵育18、24、48、72 h，制備細(xì)菌生物膜模型，用掃描電鏡觀察生物膜的形成過程。當(dāng)細(xì)菌未黏附至生物材料前，生物材質(zhì)本身的化學(xué)成分影響細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，關(guān)系到最終黏附于生物材料上的細(xì)菌數(shù)量。生物膜內(nèi)細(xì)菌寄生于體內(nèi)植入物表面形成膜狀物，包裹在導(dǎo)尿管表面，生物膜內(nèi)細(xì)菌通過特殊的耐藥機(jī)制和緩慢釋放引起患者泌尿道和全身感染[7]。如表1所示，不同材質(zhì)導(dǎo)尿管細(xì)菌生物膜情況不同。通過掃描電鏡觀察生物膜形成的動(dòng)態(tài)過程可見，生物膜形成分為兩個(gè)階段：首先由細(xì)菌表面疏水性蛋白或多糖黏附素對(duì)生物材料的初始附著，形成細(xì)菌群落；而后細(xì)菌主要通過多糖胞間黏附素介導(dǎo)，相互聚集，形成生物膜[8-10]。細(xì)菌在孵育第18～24小時(shí)增殖較慢，由于細(xì)菌被接種到培養(yǎng)基后最初的一段時(shí)間，細(xì)菌需要適應(yīng)新環(huán)境，為持續(xù)不斷地增殖做準(zhǔn)備。第48～72小時(shí)細(xì)菌分裂繁殖速度明顯增快。三種材料的生物膜內(nèi)均見細(xì)菌團(tuán)塊聚集，菌體周圍可見由纖維素樣物質(zhì)交聯(lián)的現(xiàn)象。但觀察可見，硅橡膠導(dǎo)尿管材料中，有的部位僅見大量細(xì)菌附著，纖維素樣物質(zhì)交聯(lián)相對(duì)較少。纖維素樣交聯(lián)物是細(xì)菌分泌的多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂蛋白。細(xì)菌大量聚集，其間由纖維素樣物質(zhì)交聯(lián)，可使抗生素的作用大大地減弱。掃描電鏡下圖像說明，硅橡膠材料組織相容性較好，對(duì)比純硅膠和乳膠導(dǎo)尿管，形成生物膜能力相對(duì)較差。

鑒于生物膜內(nèi)細(xì)菌生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)規(guī)律，通過不同方法對(duì)黏附大腸埃希菌的三種材質(zhì)導(dǎo)尿管進(jìn)行處理，比較兩種方法的優(yōu)劣。如表1～2所示，在生物膜形成的初期（24 h），沖洗和沖洗+超聲振蕩兩種方法處理生物膜，均能較徹底地洗脫黏附細(xì)菌，這可能與早期生長(zhǎng)細(xì)菌菌量較少及黏附不牢固有關(guān)；隨著生物膜的成熟，細(xì)菌繁殖增多，且黏附牢固，這時(shí)單用沖洗方法難于將生物膜洗脫下來，被洗脫下來的菌落數(shù)與經(jīng)超聲振蕩所得菌落數(shù)相比，已明顯減少；從沖洗組的動(dòng)態(tài)看，菌落數(shù)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)有逐漸減少的趨勢(shì)，與超聲振蕩的趨勢(shì)相反。

對(duì)臨床需要長(zhǎng)期留置導(dǎo)尿管患者，除臨床常規(guī)采取的無菌護(hù)理外，使用不同材料導(dǎo)尿管可有效較少導(dǎo)尿管相關(guān)尿路感染的發(fā)生[11]。建議選擇使用經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的硅橡膠導(dǎo)尿管，在留置導(dǎo)尿管早期進(jìn)行膀胱沖洗，可減少導(dǎo)尿管伴隨尿路感染的發(fā)生。

參考文獻(xiàn)

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（收稿日期：2013-12-20） （本文編輯：歐麗）

鑒于生物膜內(nèi)細(xì)菌生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)規(guī)律，通過不同方法對(duì)黏附大腸埃希菌的三種材質(zhì)導(dǎo)尿管進(jìn)行處理，比較兩種方法的優(yōu)劣。如表1～2所示，在生物膜形成的初期（24 h），沖洗和沖洗+超聲振蕩兩種方法處理生物膜，均能較徹底地洗脫黏附細(xì)菌，這可能與早期生長(zhǎng)細(xì)菌菌量較少及黏附不牢固有關(guān)；隨著生物膜的成熟，細(xì)菌繁殖增多，且黏附牢固，這時(shí)單用沖洗方法難于將生物膜洗脫下來，被洗脫下來的菌落數(shù)與經(jīng)超聲振蕩所得菌落數(shù)相比，已明顯減少；從沖洗組的動(dòng)態(tài)看，菌落數(shù)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)有逐漸減少的趨勢(shì)，與超聲振蕩的趨勢(shì)相反。

對(duì)臨床需要長(zhǎng)期留置導(dǎo)尿管患者，除臨床常規(guī)采取的無菌護(hù)理外，使用不同材料導(dǎo)尿管可有效較少導(dǎo)尿管相關(guān)尿路感染的發(fā)生[11]。建議選擇使用經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的硅橡膠導(dǎo)尿管，在留置導(dǎo)尿管早期進(jìn)行膀胱沖洗，可減少導(dǎo)尿管伴隨尿路感染的發(fā)生。

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（收稿日期：2013-12-20） （本文編輯：歐麗）

鑒于生物膜內(nèi)細(xì)菌生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)規(guī)律，通過不同方法對(duì)黏附大腸埃希菌的三種材質(zhì)導(dǎo)尿管進(jìn)行處理，比較兩種方法的優(yōu)劣。如表1～2所示，在生物膜形成的初期（24 h），沖洗和沖洗+超聲振蕩兩種方法處理生物膜，均能較徹底地洗脫黏附細(xì)菌，這可能與早期生長(zhǎng)細(xì)菌菌量較少及黏附不牢固有關(guān)；隨著生物膜的成熟，細(xì)菌繁殖增多，且黏附牢固，這時(shí)單用沖洗方法難于將生物膜洗脫下來，被洗脫下來的菌落數(shù)與經(jīng)超聲振蕩所得菌落數(shù)相比，已明顯減少；從沖洗組的動(dòng)態(tài)看，菌落數(shù)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)有逐漸減少的趨勢(shì)，與超聲振蕩的趨勢(shì)相反。

對(duì)臨床需要長(zhǎng)期留置導(dǎo)尿管患者，除臨床常規(guī)采取的無菌護(hù)理外，使用不同材料導(dǎo)尿管可有效較少導(dǎo)尿管相關(guān)尿路感染的發(fā)生[11]。建議選擇使用經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的硅橡膠導(dǎo)尿管，在留置導(dǎo)尿管早期進(jìn)行膀胱沖洗，可減少導(dǎo)尿管伴隨尿路感染的發(fā)生。

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（收稿日期：2013-12-20） （本文編輯：歐麗）