原花青素對(duì)2型糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度的影響

劉行海，買(mǎi)文麗，鄭 倩，劉 華，敬華娥，陳大斌

(川北醫(yī)學(xué)院 1.生理學(xué)教研室；2.寄生蟲(chóng)學(xué)教研室，四川 南充 637100)

糖尿病周?chē)窠?jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病(diabetes mellitus,DM)常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥之一，嚴(yán)重影響患者的健康與生活質(zhì)量[1]。原花青素(proanthocyanidins，PC)是植物中廣泛存在的一大類(lèi)多酚化合物的總稱(chēng)。藥理研究表明原花青素具有明顯的抗氧化、抗腫瘤、保護(hù)心血管等活性作用，臨床主要用于心肌缺血、心絞痛、腦梗塞等的輔助治療[2]。研究發(fā)現(xiàn)，氧自由基可通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化等機(jī)制參與DM及其慢性并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展[3-4]。原花青素作為強(qiáng)氧自由基清除劑，是否對(duì)DPN具有治療作用？本實(shí)驗(yàn)采用高脂飼料加小劑量鏈脲佐菌素(STZ)復(fù)制2型糖尿病大鼠模型，并以PC進(jìn)行干預(yù)，檢測(cè)大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度、血清SOD活性及丙二醛(MDA)含量，探討PC對(duì)DPN的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料與動(dòng)物

原花青素，純度95%，購(gòu)自南京澤朗植提技術(shù)有限公司，用蒸餾水配成懸液；鏈脲菌素(STZ)、戊巴比妥鈉購(gòu)自sigma公司；超氧化物歧化酶(SOD)與丙二醛(MDA)測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物工程公司，胰島素放射免疫檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所?？焖傺菧y(cè)定儀及試紙(三諾SXT-1型,長(zhǎng)沙)，神經(jīng)肌電誘發(fā)電位儀(ND-400，上海海神)。3月齡雄性Wistar大鼠,一級(jí),體質(zhì)量為(195±16) g。動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(川)2004-15。高能飼料[5]：60%常規(guī)飼料,20%蔗糖,15%豬油,5%膽固醇。常規(guī)飼料:57%碳水化合物,22%蛋白質(zhì),6%脂肪,8%纖維素,7%其它成分。動(dòng)物及飼料均由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供。

1.2 動(dòng)物模型建立與分組

T2DM大鼠模型建立參照本實(shí)驗(yàn)室既往方法[6]。自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為對(duì)照組(A)8只和實(shí)驗(yàn)組18只。實(shí)驗(yàn)組高能飼料喂養(yǎng)4周，空腹12 h后一次性腹腔注射鏈脲菌素25 mg/kg(注射前用pH=4.2的枸櫞酸緩沖液配成1%濃度)。A組注射等量的檸檬酸緩沖液，實(shí)驗(yàn)組繼續(xù)高能飼料喂養(yǎng)4周后，采尾靜脈血測(cè)定空腹血糖(FBG)、血清胰島素(FINS),計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(ISI)，以FBG≥7.8 mmol/L作為2型糖尿病模型判斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。將成功造模的16只大鼠隨機(jī)分為兩組：糖尿病組(B)、PC治療組(C)。C組：每日上午PC150 mg/kg灌胃；A組與B組：每次灌胃等量蒸餾水。動(dòng)物治療期間，自由飲水，全部大鼠常規(guī)飼料飼養(yǎng)于川北醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.3 坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度測(cè)定

藥物治療8周后，以1%戊巴比妥鈉35 mg/kg腹腔注射麻醉動(dòng)物后，俯臥位固定于操作平板上。嚴(yán)格控制室溫(20±5)℃，保持肢體溫度在37 ℃左右。用ND-400多導(dǎo)聯(lián)神經(jīng)肌電誘發(fā)電位儀檢測(cè)坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度。刺激針電極插入左坐骨切跡,記錄針電極插入踝關(guān)節(jié)處坐骨神經(jīng)經(jīng)過(guò)部位，參考電極插于記錄電極與刺激電極之間，距離記錄針電極1 cm處。采用單脈沖方波刺激，波寬0.2 ms，強(qiáng)度1.0倍閾值，每?jī)蓚€(gè)刺激之間間隔5 s及以上。記錄刺激開(kāi)始到肌肉出現(xiàn)誘發(fā)電位的時(shí)間,測(cè)定刺激電極到記錄電極之間的距離,計(jì)算運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度。

1.4 生化及放免檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)心臟取血，快速血糖測(cè)定儀測(cè)定FBG；采用751分光光度計(jì)測(cè)定SOD和MDA；放射免疫分析法測(cè)定FINS。同時(shí)摘取各組大鼠坐骨神經(jīng)于10%中性甲醛溶液中，固定24 h后常規(guī)石蠟包埋,按病理學(xué)常規(guī)制片HE染色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察

與A組大鼠比較，B組大鼠出現(xiàn)明顯的多飲，多尿，多食的癥狀，活動(dòng)減少，毛發(fā)晦暗，B組中因感染死亡一只；與B組大鼠比較，C組癥狀體征均有所好轉(zhuǎn)。

2.2 各組大鼠FBG和坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度的比較

與A組比較，B組FBG升高(P<0.01)，而C組低于B組(P<0.01)。與A組比較，B組的坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢(P<0.01)，而C組的傳導(dǎo)速度快于B組(P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血糖和神經(jīng)傳導(dǎo)速度的變化

*P<0.01，與A組比較；△P<0.01，與B組比較。

2.3 各組大鼠血清SOD活性和MDA含量比較

與A組相比，B組大鼠坐骨神經(jīng)SOD明顯降低(P<0.01)，MDA含量明顯升高(P<0.01)。C組大鼠坐骨神經(jīng)組織SOD活性較B組明顯升高(P<0.01)，MDA水平較明顯下降(P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組SOD活性和MDA含量比較

*P<0.01，與A組比較；△P<0.01，與B組比較。

2.4 各組大鼠血清胰島素水平和胰島素敏感指數(shù)比較

與A組比較，B組大鼠FINS水平顯著升高(P<0.01)，ISI顯著降低(P<0.05);與B組比較，C組大鼠FINS水平顯著降低(P<0.01)，ISI顯著升高(P<0.05)。

表3 藥物治療對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠血清FINS、ISI的影響

*P<0.01，與A組比較；#P<0.05，△P<0.01，與B組比較。

2.5 坐骨神經(jīng)HE染色

與A組相比較，B組大鼠坐骨神經(jīng)有纖維排列紊亂、松散和斷裂的病理改變；C組大鼠坐骨神經(jīng)病理改變較B組輕。

3 討論

近年來(lái)，2型糖尿病發(fā)病呈快速上升趨勢(shì)，而DPN在糖尿病并發(fā)癥中又具有發(fā)病早、發(fā)病率高的特點(diǎn)。有研究表明以下機(jī)制參與了DPN發(fā)生和發(fā)展：血糖升高；脂質(zhì)代謝紊亂；過(guò)氧化物產(chǎn)生過(guò)多；抗氧化能力的下降；氧自由基通過(guò)與細(xì)胞膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)[8]。

MDA為脂質(zhì)過(guò)氧化代謝產(chǎn)物,它的變化可間接地反映出細(xì)胞損傷的程度；SOD是體內(nèi)主要的抗氧化酶，其變化反應(yīng)了機(jī)體的抗氧化能力。本實(shí)驗(yàn)參照以往造模方法，成功復(fù)制與2型糖尿病病理狀況相符的大鼠模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模型B組大鼠有相對(duì)穩(wěn)定的高血糖，胰島素抵抗以及多食多飲多尿等癥狀和體征。B組大鼠血清SOD活性降低，MDA明顯高于正常A組，提示2型糖尿病大鼠脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)增強(qiáng)，抗自由基損傷能力降低，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[9]。

檢測(cè)DPN較為敏感的指標(biāo)是坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度降低，因此檢測(cè)大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度可合理地判斷DPN的治療效果[10]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示C組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度增快，坐骨神經(jīng)病理學(xué)改變較B組輕，說(shuō)明原花青素對(duì)T2DM大鼠周?chē)窠?jīng)病變具有一定的保護(hù)作用。原花青素具有很強(qiáng)的抗氧化活性，是一種很好的氧自由基清除劑和脂質(zhì)過(guò)氧化抑制劑。經(jīng)原花青素治療8周后，C組與B組相比，血清中SOD活性升高，MDA含量明顯降低。并且治療后的C組大鼠雖血糖仍比A組大鼠高，但和未治療的B組大鼠相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究結(jié)果說(shuō)明原花青素能夠改善2型糖尿病大鼠血糖水平和提高機(jī)體抗氧化能力，這可能是原花青素影響DPN發(fā)展的機(jī)制之一。

綜上所述，本研究提示原花青素對(duì)T2DM大鼠周?chē)窠?jīng)病變具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其抗氧化作用和降低血糖有關(guān)，至于原花青素使用的最佳時(shí)機(jī)及濃度等有待進(jìn)一步研究。

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