近視遺傳學(xué)研究進(jìn)展

廖 萱，蘭長(zhǎng)駿

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科，四川 南充 637000)

近視是一種常見的屈光不正，在全世界范圍人群中有很高的發(fā)病率。近幾十年來(lái)，近視的發(fā)病率和嚴(yán)重程度均呈快速增加的趨勢(shì)，尤其以包括中國(guó)在內(nèi)的東亞國(guó)家的青少年兒童表現(xiàn)更為明顯。隨著近視度數(shù)增加和眼軸延長(zhǎng)，發(fā)生眼部病理性改變和合并癥的風(fēng)險(xiǎn)亦明顯增加，甚至可以發(fā)生不可逆的視功能喪失的嚴(yán)重后果，同時(shí)帶來(lái)沉重的社會(huì)負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，成為重要的全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。近視的病因和發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，尋求有效的防治方法一直是眼科和視覺研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。普遍認(rèn)為單純性近視是遺傳-環(huán)境因素的多向相互作用(基因-基因累積作用/基因-環(huán)境交互作用)引起的多基因復(fù)雜疾病，遺傳因素對(duì)于近視的發(fā)生發(fā)展極其重要。然而在易感基因的定位和遺傳分析中仍存在很多懸而未決的問(wèn)題?，F(xiàn)代分子生物學(xué)和遺傳學(xué)技術(shù)的革命性進(jìn)步，提供了一個(gè)前所未有的機(jī)會(huì)來(lái)破譯近視的病因和發(fā)病機(jī)理。隨著研究越來(lái)越深入，遺傳標(biāo)記已從細(xì)胞學(xué)標(biāo)記和生化標(biāo)記發(fā)展到能夠直接反映DNA分子水平差異的分子標(biāo)記，尋找遺傳易感基因突變位點(diǎn)的策略由定位克隆改變?yōu)椴捎萌蚪M掃描策略，下一代測(cè)序技術(shù)消除了罕見變異檢測(cè)的技術(shù)障礙，基因組的研究重心由結(jié)構(gòu)向功能研究轉(zhuǎn)變，近視的遺傳學(xué)研究已經(jīng)進(jìn)入一個(gè)全新的階段。

1 遺傳標(biāo)記

遺傳標(biāo)記(genetic marker)是用來(lái)區(qū)分不同的個(gè)體或種群，能夠穩(wěn)定遺傳的性狀或物質(zhì)，是遺傳分析不可缺少的重要工具。從廣義的角度，指反映遺傳多態(tài)性且遵循遺傳規(guī)律的全部生物特征；從狹義的角度，指反映個(gè)體或群體間基因組差異的DNA位點(diǎn)或序列。自19世紀(jì)中期Mendel首先將豌豆形態(tài)學(xué)性狀作為遺傳標(biāo)記以來(lái)，其逐漸得到發(fā)展和豐富，形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生物化學(xué)及免疫學(xué)標(biāo)記等被廣泛應(yīng)用。DNA分子標(biāo)記(molecular marker)直接反映核酸水平上的遺傳變異，消除了環(huán)境影響，遺傳穩(wěn)定且信息量大，是目前的主要的遺傳標(biāo)記。DNA分子標(biāo)記經(jīng)歷了以下幾個(gè)階段的發(fā)展。

1.1 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性

1974年Grodzicker等[2]首次提出將限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)用作腺病毒溫度敏感突變的遺傳標(biāo)記，開創(chuàng)了直接應(yīng)用DNA多態(tài)性作為遺傳標(biāo)記的新階段。1987年人類基因組第一張RFLP標(biāo)記圖譜發(fā)表，RFLP作為第一代DNA分子標(biāo)記開始被廣泛應(yīng)用。由于DNA序列上限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的堿基發(fā)生突變或替換，使得原有酶切位點(diǎn)消失或產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)；或限制性酶切位點(diǎn)之間發(fā)生了堿基的插入或缺失，使得酶切位點(diǎn)相對(duì)位移或DNA內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生重排。因此，用限制性內(nèi)切酶消化后就會(huì)產(chǎn)生長(zhǎng)度不同的DNA片段，即RFLP。這些不同大小DNA片段，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)或者Southern blot轉(zhuǎn)膜雜交后，即可以分出不同的基因型，從而揭示出遺傳位點(diǎn)的多態(tài)性。由于RFLP多態(tài)性標(biāo)記的等位基因具有共顯性的特點(diǎn)，易于區(qū)分純合型和雜合型，并且結(jié)果穩(wěn)定可靠，因而在近視的易感基因位點(diǎn)篩選中得到廣泛應(yīng)用，鑒定出一些高度近視候選基因。但由于RFLP檢測(cè)較難自動(dòng)化，在全基因組上的分布密度較低，多態(tài)性頻率也較低，使得應(yīng)用受到一定的限制。

1.2 微衛(wèi)星多態(tài)性

1989年Litt等[3]發(fā)現(xiàn)了微衛(wèi)星多態(tài)性(microsatellite polymorphism，MP)在人心肌肌動(dòng)蛋白基因中的存在，MP作為第二代DNA標(biāo)記開始被認(rèn)識(shí)。微衛(wèi)星也稱簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)(simple sequence repeats，SSRs)或短串聯(lián)重復(fù)(short tandem repeats，STRs)，由核心序列和側(cè)翼序列組成。核心DNA序列呈串聯(lián)重復(fù)排列，重復(fù)單位一般由2～6個(gè)核苷酸構(gòu)成，重復(fù)次數(shù)n為幾次到數(shù)十次，以(CA)n、(AAAN)n、(AAN)n和(GT)n較為常見；側(cè)翼DNA序列位于核心序列的兩端，為保守的特異單拷貝序列，能使微衛(wèi)星特異地定位于染色體常染色質(zhì)區(qū)的特定部位。微衛(wèi)星產(chǎn)生的機(jī)制被認(rèn)為是由復(fù)制滑脫(replication slippage)或DNA滑動(dòng)鏈與互補(bǔ)鏈堿基錯(cuò)配，導(dǎo)致一個(gè)或幾個(gè)重復(fù)單位插入或缺失而產(chǎn)生。MP因不同的重復(fù)單位以及不同的重復(fù)次數(shù)構(gòu)成多態(tài)性，使其在不同人群、不同種族間分布具有差異性。微衛(wèi)星標(biāo)記的檢測(cè)通常通過(guò)分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物有無(wú)特異性帶型，并比較擴(kuò)增產(chǎn)物的大小的方式，檢測(cè)出不同個(gè)體在每個(gè)微衛(wèi)星座位上的遺傳結(jié)構(gòu)。雖然MP標(biāo)記具有分布廣泛、信息豐富、檢測(cè)相對(duì)簡(jiǎn)便而高效等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛地用于高度近視易感位點(diǎn)研究，但是可能出現(xiàn)同源異型或異源同型，以及無(wú)效等位基因，也給微衛(wèi)星DNA標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用帶來(lái)困難。

1.3 單核苷酸多態(tài)性

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)作為第三代DNA分子標(biāo)記開啟了新的分子標(biāo)記時(shí)代[4]。1998年Wang等[5]首先報(bào)道了根據(jù)SNP技術(shù)建立的人類遺傳圖譜。SNP是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸堿基的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，在人群中這種變異的發(fā)生頻率一般大于1%；而小于1%被認(rèn)為是點(diǎn)突變。通常把人類基因組中最小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)>5%的SNP稱為常見變異，≤5%為稀有變異或低頻變異。在基因組DNA中的任何堿基均有可能發(fā)生變異。在蛋白質(zhì)編碼區(qū)的SNP和位于表達(dá)調(diào)控序列中的SNP在功能或致病方面具有更重要的意義，常常被稱為功能多態(tài)。SNP分布并不均勻，由于選擇壓力等原因，絕大多數(shù)SNP位于非編碼區(qū)，位于基因組中蛋白質(zhì)編碼的序列僅約為3%。

SNP是人類可遺傳的變異中最常見的一種，占所有已知多態(tài)性的90%以上[6]。據(jù)估計(jì)在人類基因組中兩個(gè)無(wú)親緣關(guān)系的個(gè)體間平均每1000個(gè)核苷酸中就有一個(gè)以上的SNP，因此整個(gè)人類基因組中存在300萬(wàn)個(gè)以上的SNP，覆蓋全基因組的0.4%[5]。SNP位點(diǎn)并不是獨(dú)立遺傳的，而是一組位置比較接近的且?guī)缀醪话l(fā)生重組的連鎖不平衡SNP位點(diǎn)(即單體域haplotype block)一同遺傳。雖然SNP在任一特定位點(diǎn)上只有兩個(gè)等位基因，所涵蓋的信息量有限，但是SNP在基因組中數(shù)量巨大且分布頻密，所以整體而言其多態(tài)性遠(yuǎn)高于RFLP與MP；而且SNP是基于單核苷酸的突變，遺傳穩(wěn)定性相對(duì)較高，具有比MP更準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)[7]。其二態(tài)性易于基因分型和等位基因頻率估計(jì)，適合復(fù)雜疾病的易感基因或致病基因研究。

1.4 拷貝數(shù)變異

人類基因組遺傳變異有許多種形式，從顯微鏡可見的染色體到微觀的單核苷酸突變，也有許多DNA片段大小為kb到Mb范圍內(nèi)亞微觀的拷貝數(shù)。2004年Sebat[8]和Iafrate[9]各自所在的研究小組首次在人類基因組中描述了拷貝數(shù)變異(copy number variation，CNV)的存在，指出有兩個(gè)大片段的CNV可以導(dǎo)致出生缺陷等重大疾病，其多態(tài)性也成為一種新的遺傳標(biāo)記在人類基因組中被廣泛地研究。之后，更多的研究小組發(fā)現(xiàn)CNV與疾病有著密切的聯(lián)系。CNV是基因組結(jié)構(gòu)變異的一種形式[10]。與SNP類似，CNV除了一部分會(huì)致病以外，也可以作為一種遺傳多態(tài)性存在于人類及其他物種的基因組上。相對(duì)于SNP的概念，將人群中等位基因頻率大于1%的CNV定義為基因組拷貝數(shù)多態(tài)(copy number polymorphisms,CNP)，90%以上的CNV屬于這一類型，而小于1%的CNV稱為罕見CNV。

人類基因組內(nèi)大約存在1 500個(gè)CNV區(qū)域，覆蓋基因組的12%[11]。CNV產(chǎn)生的機(jī)制與減數(shù)分裂時(shí)期的DNA重組、DNA毀壞后的錯(cuò)誤修復(fù)、DNA移動(dòng)元件的活動(dòng)等有關(guān)。CNV為揭示生物遺傳和變異的分子基礎(chǔ)提供了新的思路。雖然目前發(fā)現(xiàn)的人類基因組中SNP的個(gè)數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于CNV，但CNV在整個(gè)基因組中覆蓋的核苷酸總數(shù)卻大大超過(guò)SNP的總數(shù)，結(jié)合這兩種遺傳標(biāo)記進(jìn)行研究，將為認(rèn)識(shí)人類基因組的構(gòu)成、個(gè)體間的遺傳差異、遺傳致病因素提供新的線索，深入理解復(fù)雜疾病的分子機(jī)制和遺傳基礎(chǔ)提供理論依據(jù)。

2 大型國(guó)際基因組項(xiàng)目

從50年代的遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)模型的提出，到90年代開始的國(guó)際人類基因組計(jì)劃興起的基因組學(xué)革命，科學(xué)家們一直致力于解讀人類遺傳的信息，揭開人類奧秘的基礎(chǔ)。隨著大型國(guó)際基因組項(xiàng)目的相繼開展與完成，人類基因組研究已經(jīng)成為生命科學(xué)發(fā)展的主線，對(duì)于包括近視在內(nèi)的多種疾病遺傳研究起著重要的推動(dòng)作用。

2.1 國(guó)際人類基因組計(jì)劃

國(guó)際人類基因組計(jì)劃(the international human genome project，HGP)[12]于1990年啟動(dòng)，旨在闡明人類基因組30億核苷酸的序列，發(fā)現(xiàn)所有人類基因并闡明其在染色體上的位置，使得人類第一次在分子水平上全面地認(rèn)識(shí)自我。2003年個(gè)人完整基因組序列圖譜的繪制，提供了研究基因結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)。直至2006年人類最后一個(gè)染色體-l號(hào)染色體的基因測(cè)序結(jié)果公布，HGP經(jīng)歷16年，圖譜精確度覆蓋了人類基因組的99.99%。同時(shí)人們發(fā)現(xiàn)，完成的HGP只是一個(gè)以測(cè)序?yàn)橹鞯慕Y(jié)構(gòu)基因組學(xué)研究，真正揭示基因組的功能也許是整個(gè)21世紀(jì)的任務(wù)。HGP的內(nèi)涵及外延在不斷地?cái)U(kuò)展。

2.2 國(guó)際人類基因組單體型圖計(jì)劃

國(guó)際人類基因組單體型圖計(jì)劃(the international HapMap project，HapMap)[13-14]相繼在2002年啟動(dòng)，構(gòu)建了人類基因組中常見遺傳變異的等位基因和基因型頻率以及單體型形式，提供了洞察人類基因組差異的窗口和關(guān)聯(lián)研究的有力工具。HapMap分別在2005年和2007年公布了第Ⅰ和Ⅱ期的數(shù)據(jù)，分別對(duì)4個(gè)種群的270個(gè)個(gè)體樣本，超過(guò)100萬(wàn)SNP和200萬(wàn)SNP進(jìn)行基因分型；在2010年公布了第Ⅲ期的數(shù)據(jù)，增加了6個(gè)種群，樣本擴(kuò)展到1 115個(gè)個(gè)體，檢測(cè)SNP約155萬(wàn)個(gè)，基因分型的精度已達(dá)單個(gè)核苷酸水平。所有數(shù)據(jù)免費(fèi)向公眾開放并發(fā)布在共享數(shù)據(jù)庫(kù)(www.hapmap.org)。受前期的測(cè)序技術(shù)所限，HapMap計(jì)劃僅對(duì)人類基因組中常見遺傳變異的SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。隨著高通量基因分型和測(cè)序技術(shù)的發(fā)展以及千人基因組計(jì)劃的展開，人類遺傳學(xué)研究進(jìn)入了一個(gè)新的時(shí)代。

2.3 千人基因組計(jì)劃

千人基因組計(jì)劃(the 1 000 genomes project，1 000 Genomes)[15-16]自2008年啟動(dòng)，目標(biāo)在于組裝大量個(gè)人的基因組全序列數(shù)據(jù)，繪制出最為詳盡的人類全基因組遺傳多態(tài)性圖譜，提供更精確全面的遺傳變異信息和人類基因組結(jié)構(gòu)變異的公共數(shù)據(jù)庫(kù)(www.1000genomes.org)。通過(guò)研究數(shù)以千計(jì)的個(gè)體，建立不同人種中所有常見變異及絕大部分稀有變異的深度目錄，有助于更廣泛地分析與疾病有關(guān)的基因變異。第一階段研究進(jìn)行三項(xiàng)前期實(shí)驗(yàn)，旨在評(píng)估研究覆蓋率、方法、平臺(tái)和機(jī)構(gòu)，以確定全基因組測(cè)序的最好策略。第一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)包括對(duì)2個(gè)核心家庭的基因組進(jìn)行的全基因組測(cè)序；第二項(xiàng)包括對(duì)來(lái)自4個(gè)種群的179個(gè)體進(jìn)行全基因組測(cè)序；第三項(xiàng)包括對(duì)來(lái)自7個(gè)種群的697個(gè)體進(jìn)行外顯子測(cè)序。前期數(shù)據(jù)已在2009年發(fā)布。第二階段計(jì)劃對(duì)7個(gè)種群的2 500個(gè)體的基因組進(jìn)行4×覆蓋度測(cè)序和外顯子靶向測(cè)序，目前也取得了階段性成果，2012年公布了包含14個(gè)國(guó)家和地區(qū)1 092人的基因數(shù)據(jù)的高分辨率人類基因組遺傳變異整合圖譜。從人類基因組計(jì)劃耗費(fèi)10多年才繪出個(gè)人的完整基因組圖譜，到千人基因組計(jì)劃短短4年間就已獲得超過(guò)1 000人的基因組數(shù)據(jù)，見證了基因組研究的高速發(fā)展，在全基因組范圍內(nèi)篩檢與疾病相關(guān)的遺傳變異成為可能。

2.4 DNA元素百科全書

然而HGP發(fā)現(xiàn)基因組中僅有1.5%的序列是給蛋白質(zhì)編碼的，而對(duì)其余98.5%的序列知之甚少。為了完成HGP遺留的任務(wù)，2003年啟動(dòng)了又一項(xiàng)大型國(guó)際合作項(xiàng)目——DNA元素百科全書(Encyclopedia of DNA Elements，ENCODE)[17]。ENCODE項(xiàng)目旨在識(shí)別出人類基因組序列中的所有功能元件，包括轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄因子聯(lián)合、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和組蛋白修飾區(qū)，繪制人類基因組甲基化可變位點(diǎn)的表觀基因組圖譜。對(duì)至少147種細(xì)胞類型進(jìn)行了1 648項(xiàng)計(jì)算機(jī)分析、生物化學(xué)試驗(yàn)以及測(cè)序研究，目前已經(jīng)確認(rèn)約80%的基因組都具備某種功能，包括7萬(wàn)多個(gè)啟動(dòng)子區(qū)，負(fù)責(zé)與蛋白質(zhì)結(jié)合控制基因表達(dá)；近40萬(wàn)個(gè)增強(qiáng)子區(qū)，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)遠(yuǎn)距離基因的表達(dá)。研究者分離了基因組中轉(zhuǎn)錄的RNA并進(jìn)行測(cè)序，識(shí)別出約120種轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合位點(diǎn)，作用相當(dāng)于控制基因活性的開關(guān)；繪制了基因組中被甲基團(tuán)覆蓋的區(qū)域圖，被甲基團(tuán)覆蓋通常表明這里的基因是沉默的；檢驗(yàn)了組蛋白的化學(xué)修飾方式，這種修飾有助于將DNA包裝成染色體，增強(qiáng)或抑制基因表達(dá)區(qū)；用DNaseI的酶繪制了125個(gè)細(xì)胞型中的調(diào)節(jié)區(qū)，這種酶對(duì)與組蛋白結(jié)合的DNA影響很小，卻會(huì)切斷與其他調(diào)節(jié)蛋白連接的DNA，如轉(zhuǎn)錄因子。ENCODE歷時(shí)十年的工程取得重大進(jìn)展，將進(jìn)一步詮釋遺傳變異調(diào)控的機(jī)制，對(duì)生命科學(xué)研究領(lǐng)域產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。

3 遺傳學(xué)研究方法

染色體不能直接用來(lái)測(cè)序，因此首先要將基因組分解為較易操作的小的結(jié)構(gòu)區(qū)域，這個(gè)過(guò)程簡(jiǎn)稱為作圖(mapping)，是遺傳學(xué)研究的主要方法，分為遺傳圖和物理圖，在此基礎(chǔ)上整合并引入基因標(biāo)志形成轉(zhuǎn)錄圖或基因圖。利用遺傳作圖進(jìn)行連鎖分析(linkage analysis)和關(guān)聯(lián)研究(association study)是尋找近視致病基因的主要策略。

3.1 連鎖分析

連鎖分析通過(guò)鑒定經(jīng)多代傳遞仍完整的單體型為基礎(chǔ)，檢測(cè)在一個(gè)家系中等位基因和疾病的傳遞是否相關(guān)。迄今為止，已識(shí)別出人類基因組中近視相關(guān)的基因片段三十多個(gè)，經(jīng)國(guó)際人類基因命名委員會(huì)通過(guò)并已在OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(www.ncbi.nlin.nih.gov/omim)編碼的基因位點(diǎn)共有23個(gè)(MYP1～MYP23)。這些易感區(qū)域分布在絕大多數(shù)染色體上，主要為常染色體顯性遺傳，少數(shù)是常染色體隱性(MYP18)或性連鎖隱性遺傳(MYP1、MYP13)。部分基因位點(diǎn)多次被后續(xù)研究證實(shí)，為近視的遺傳異質(zhì)性研究提供了有力的證據(jù)。

另外有一些新鑒定的位點(diǎn)尚未被OMIM收錄。Wojciechowski等[18]在舊時(shí)阿米什人(Old Order Amish)和高加索人近視家系中進(jìn)行全基因組連鎖分析(genome-wide linkage study，GWLS)研究，發(fā)現(xiàn)5qter與舊時(shí)阿米什人近視相關(guān)，12q24和4q21與高加索人近視相關(guān)，進(jìn)一步meta分析顯示4q21-22在已知的MYP9和MYP11位點(diǎn)附近。Abbott[19]采用GWLS和數(shù)量性狀位點(diǎn)(quantitative trait locus，QTL)定位，在迄今最大規(guī)模的高度近視家系樣本中，鑒定出兩個(gè)新的潛在位點(diǎn)6q13-16.1和5q35.1-35.2，同時(shí)也驗(yàn)證了先前的近視相關(guān)位點(diǎn)。然而復(fù)雜疾病具有多種因素參與疾病的進(jìn)程，單個(gè)基因的作用效應(yīng)微弱，遺傳異質(zhì)或表型異質(zhì)性，外顯不完全或擬表型，遺傳傳遞機(jī)制不確定等特點(diǎn)。雖然連鎖分析對(duì)于發(fā)現(xiàn)主效基因十分有效，但是對(duì)于中效或微效基因的檢出率較差；基于高度近視家系發(fā)現(xiàn)的高外顯率位點(diǎn)，難以代表散發(fā)近視病例的低外顯性突變；所定位區(qū)域往往包含眾多信息，確定具體的易感基因或位點(diǎn)尚需要大量的工作。因此，連鎖分析雖然在單基因遺傳病的基因定位方面取得了較大的成功，但是難以定位表型影響效應(yīng)較小的遺傳變異，也難以對(duì)易感基因和致病變異進(jìn)行精確定位，從而限制了連鎖研究在尋找近視致病基因中的作用。

3.2 候選基因關(guān)聯(lián)研究

關(guān)聯(lián)研究是通過(guò)鑒定經(jīng)數(shù)代傳遞后仍保留完好的相鄰近DNA變異之間的DNA片段，檢測(cè)在一個(gè)群體中等位基因與疾病的相關(guān)性是否存在。因此，關(guān)聯(lián)研究也可視作是在未觀察到的、可能存在的家系中進(jìn)行的大規(guī)模的連鎖分析。關(guān)聯(lián)研究依據(jù)連鎖不平衡的原理，通過(guò)遺傳標(biāo)記在不同群體中的分布差異來(lái)揭示其與疾病的質(zhì)量或數(shù)量性狀間的關(guān)系，從而發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的遺傳標(biāo)記。

候選基因關(guān)聯(lián)研究(candidate gene association study)基于整合信息學(xué)策略，包括功能候選策略，即通過(guò)病理生理功能信息進(jìn)行功能分析及或已知功能基因的同源比較；或者位置候選策略，即通過(guò)基因圖譜信息進(jìn)行初步或精細(xì)定位；以及利用比較組學(xué)信息或挖掘文獻(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行候選，搜尋致病相關(guān)的候選基因進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究。目前近視遺傳關(guān)聯(lián)研究的候選基因主要涉及兩大類：鞏膜細(xì)胞外基質(zhì)生長(zhǎng)和重塑的相關(guān)基因，如蛋白聚糖類(proteoglycans[20])，膠原類(collagens[21])，纖維蛋白類(fibrillarin[22])，細(xì)胞黏附遷移相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases[23])以及類尿調(diào)節(jié)素I基因[24]，生長(zhǎng)因子及其受體(growth factors and their receptors[25])；以及視網(wǎng)膜視覺信號(hào)處理和傳輸?shù)南嚓P(guān)基因，如夜盲蛋白NYX基因[26]，血管活性腸肽受體VIPR2[27]，維生素D受體VDR[28]等。這些被鑒定的近視相關(guān)候選基因和位點(diǎn)中，很少處于先前已經(jīng)鑒定的非綜合征近視的連鎖峰值中，在不同的研究中結(jié)果并不能被重復(fù)驗(yàn)證。而且這種假設(shè)驅(qū)動(dòng)的方法(hypothesis-driven)只針對(duì)已知的候選基因，未能從整體角度系統(tǒng)考察基因組所有的遺傳變異，在探尋高度近視致病基因方面難以有重大的發(fā)現(xiàn)和突破。

3.3 全基因組關(guān)聯(lián)研究

全基因組檢測(cè)的無(wú)偏特性(hypothesis free)加上關(guān)聯(lián)研究的統(tǒng)計(jì)效能的提高，高通量基因分型技術(shù)和新興生物統(tǒng)計(jì)學(xué)方法的迅猛發(fā)展，全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association studies，GWAS)成為目前探索復(fù)雜疾病遺傳易感因素最為有效的研究辦法。迄今已有數(shù)項(xiàng)GWAS對(duì)近視遺傳易感基因SNP位點(diǎn)進(jìn)行了探索，不僅驗(yàn)證了既往候選基因關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)的高度近視候選基因,還鑒定出多個(gè)近視相關(guān)的新易感區(qū)域或位點(diǎn)，極大地更新了對(duì)近視遺傳背景的認(rèn)識(shí)[29-35]。后期的GWAS更聯(lián)合國(guó)際和國(guó)內(nèi)多中心研究，采用數(shù)以萬(wàn)計(jì)的大樣本量，協(xié)同遺傳統(tǒng)計(jì)學(xué)和生物信息學(xué)等多學(xué)科，顯著地提高了統(tǒng)計(jì)效能，獲得更多的遺傳信息。

Verhoeven等[34]以分別來(lái)自27個(gè)歐洲研究隊(duì)列和5個(gè)亞洲研究隊(duì)列的45 758名屈光不正人群為研究對(duì)象，利用Illumina和Affymetrix平臺(tái)鑒定出與屈光不正相關(guān)的24個(gè)新位點(diǎn)。通過(guò)評(píng)價(jià)作為活性調(diào)控因子標(biāo)志的H3K27a修飾和HaploReg注釋的乙?；l(fā)現(xiàn)許多關(guān)聯(lián)位點(diǎn)包含有這些調(diào)控因子，推測(cè)調(diào)控功能可能也是一個(gè)潛在的機(jī)制。這些發(fā)現(xiàn)更深化了對(duì)近視發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)。Kiefer等[35]在歐洲人群中進(jìn)行了迄今為止最大的近視GWAS，包含兩階段的研究對(duì)象共54094例，鑒定出20個(gè)與ECM重塑、視覺循環(huán)、眼球生長(zhǎng)以及視網(wǎng)膜神經(jīng)元發(fā)育或信號(hào)的聯(lián)系等與近視發(fā)生發(fā)展相關(guān)的新易感位點(diǎn)/基因。最顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)rs12193446位于LAMA2基因的內(nèi)含子內(nèi)，風(fēng)險(xiǎn)比(hazard ratio，HR)及可信區(qū)間為0.79(0.76，0.81)。研究構(gòu)建了Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行近視初始發(fā)病年齡的全基因組生存分析，結(jié)果支持視覺誘發(fā)信號(hào)激發(fā)的視網(wǎng)膜到鞏膜的級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致近視發(fā)生發(fā)展的模式，提示早期的眼球和神經(jīng)元發(fā)育對(duì)于人類近視的發(fā)生發(fā)展的重要性。GWAS已經(jīng)產(chǎn)生了海量數(shù)據(jù)，有待進(jìn)一步地處理和有效地利用。

3.4 下一代測(cè)序

GWAS基于“常見疾病/常見變異”(common disease common variants,CDCV)假說(shuō)[36]，并未涵蓋人類基因組中稀有遺傳變異和其他結(jié)構(gòu)變異。由于自然進(jìn)化中選擇壓力的存在，稀有變異往往是新近發(fā)生的效力較強(qiáng)的有害變異[37]。不斷涌現(xiàn)的研究結(jié)果表明，稀有遺傳變異對(duì)某些復(fù)雜疾病的發(fā)生起著關(guān)鍵性的作用，解釋基因-變異-環(huán)境因素之間的相互作用關(guān)系需要對(duì)更多微效基因稀有變異進(jìn)行研究。目前GWAS所研究的對(duì)象主要是SNP，對(duì)SNP以外的其它結(jié)構(gòu)變異并不敏感，例如MP及CNV等等，這些變異包含了多個(gè)核苷酸，往往可以影響到基因的表達(dá)，因此可能涉及相當(dāng)一部分復(fù)雜疾病的遺傳易感性。對(duì)于MAF≤5%甚至MAF≤5‰的稀有遺傳變異以及其他結(jié)構(gòu)變異的探索和研究，將隨著下一代測(cè)序技術(shù)(next generation sequencing，NGS)的發(fā)展逐漸深化。

全基因組測(cè)序(whole genome sequencing，WGS)可以鑒定人類基因組序列的所有變異，但目前成本仍然較高；外顯子組測(cè)序(whole exome sequencing，WES)相對(duì)成本低，可以系統(tǒng)分析基因組中蛋白編碼區(qū)域的主要遺傳變異[38]。通過(guò)WES技術(shù)，Shi等[39]已經(jīng)鑒定出近視位點(diǎn)MYP21(1p22.2)并被OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)收錄(OMIM 614167)；最近兩項(xiàng)研究分別鑒定出LRPAP1基因的突變[40]，以及SCO2基因終止密碼子突變c.157C>T[41]與高度近視有關(guān)。目標(biāo)區(qū)域再測(cè)序(targeted resequencing)在已經(jīng)鑒定的連鎖峰值區(qū)域進(jìn)一步測(cè)序分析，也是成本相對(duì)較低的有效手段。Mordechai等[42]通過(guò)對(duì)以色列貝都因人常染色體隱性遺傳的高度近視家族進(jìn)行全基因組連鎖研究以及目標(biāo)區(qū)域再測(cè)序，將高度近視易感位點(diǎn)定位與染色體3q28上1.7Mb的區(qū)域。利用新一代測(cè)序技術(shù)，針對(duì)全基因組、外顯子組或GWAS識(shí)別的候選易感區(qū)域進(jìn)行高通量測(cè)序和關(guān)聯(lián)分析，繼而在獨(dú)立人群中驗(yàn)證，有望快速準(zhǔn)確識(shí)別已有變異并有效發(fā)現(xiàn)新的低頻和罕見變異。

4 展望

分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步為近視遺傳學(xué)研究提供了新的手段，近視基因組學(xué)研究已經(jīng)取得了重要進(jìn)展并積累了海量的研究數(shù)據(jù)，下一代測(cè)序技術(shù)也將隨著更高通量和更低成本在近視的遺傳學(xué)研究中發(fā)揮更大作用。而完全揭示近視遺傳機(jī)制，并最終實(shí)現(xiàn)近視的個(gè)體化醫(yī)療，仍然面臨許多挑戰(zhàn)。

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