戊巴比妥鈉在2型糖尿病大鼠模型復(fù)制中的應(yīng)用研究

劉 華，劉行海，馮 乾，張 婷，買文麗，蘭海濤，鄭 倩，劉 紅

(川北醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，四川 南充 637100)

中國是世界上糖尿病患者最多的國家，目前患病人數(shù)已經(jīng)超過9 200萬[1]，每年全球有大約300多萬人死于糖尿病，有600多萬人成為新的糖尿病患者[2]。所以，對(duì)糖尿病的研究任務(wù)仍然緊迫而艱巨。因?yàn)樘悄虿∧Ｐ蛯?duì)糖尿病的基礎(chǔ)研究具有重要的實(shí)用價(jià)值，因此近年來成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

目前，國內(nèi)外廣泛使用“高脂飼養(yǎng)+小劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)”的方法誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型[3-4]。在長期實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)這種造模方法仍然存在一些明顯的缺陷，主要體現(xiàn)在：(1)造模成功率不高，一般只能達(dá)到50%左右；(2)動(dòng)物模型穩(wěn)定性差，2～4周后部分模型自愈轉(zhuǎn)陰，部分模型由于血糖持續(xù)升高而死亡；(3)復(fù)制的同批次模型大鼠個(gè)體間血糖值差異性較大；(4)如果采用STZ連續(xù)3～5 d注射，雖然可以提高成模率，但是遠(yuǎn)期動(dòng)物死亡率和批量復(fù)制費(fèi)用也會(huì)顯著增加[5-6]。本實(shí)驗(yàn)通過在動(dòng)物一次性注射小劑量STZ前給予戊巴比妥鈉預(yù)處理，使全部動(dòng)物在STZ作用的有效期內(nèi)都處于相似的機(jī)能狀態(tài)，從而盡量避免上述缺陷和提高糖尿病模型質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑

雄性Wistar大鼠50只，清潔級(jí)，重量180～200 g。動(dòng)物及飼料均由川北醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。STZ與戊巴比妥鈉均為Sigma公司產(chǎn)品，膽固醇與豬膽酸鹽購自南京生化制藥廠，血糖測(cè)定儀為長沙三諾科技公司產(chǎn)品。高脂飼料配方：常規(guī)飼料65%，12%豬油，20%蔗糖，2.5%膽固醇，0.5%豬膽酸鹽。

1.2 動(dòng)物模型建立與分組

全部實(shí)驗(yàn)大鼠分為三組：正常對(duì)照組(N組)，n=10；模型復(fù)制對(duì)照組(C組)，n=20；實(shí)驗(yàn)觀察組(T組)，n=20。N組全程常規(guī)飼料喂養(yǎng)，腹腔注射時(shí)用等量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液作為對(duì)照處理；C組高能飼料飼養(yǎng)4周后，禁食12 h，一次性腹腔注射STZ 30 mg/kg(STZ臨時(shí)用0.1 mol/L，pH=4.2的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配成0.3%的終濃度)，繼續(xù)高能飼料飼養(yǎng)4周；T組用1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉后再給予STZ，其余處理同C組。在STZ注射后第2、4、6、8周末采尾靜脈血測(cè)定空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)和體重，以FBG>7.8 mmol·L-1作為T2DM模型的判斷標(biāo)準(zhǔn)[7-8]。在STZ注射后第8周末，斷髓處死動(dòng)物，迅速摘取每組動(dòng)物胰腺組織和肝臟組織放入10%甲醛溶液中固定后用于常規(guī)病理切片并行HE染色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 STZ注射后各組大鼠FBG和體重的變化

C組大鼠和T組大鼠在STZ注射后血糖逐漸升高，注射4周后，兩組大鼠體重呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)。C組動(dòng)物病情呈分化狀態(tài)，部分動(dòng)物血糖逐漸下降，恢復(fù)正常，部分動(dòng)物病情持續(xù)加重，甚至死亡。與C組比較，T組大鼠血糖在STZ注射后第2、4、6、8周均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，STZ注射后第8周實(shí)驗(yàn)觀察組大鼠體重有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，其余各時(shí)期比較體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)果見表1。

表1 STZ注射后各組大鼠血糖和體重的變化

*P<0.01，與C組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較。

2.2 STZ注射后各組大鼠各時(shí)期成模率和死亡率比較

由表2可見，各時(shí)期比較：T組大鼠成模率均顯著高于C組(P<0.01)，而死亡率顯著低于C組(P<0.01)。第4周兩組大鼠成模率均最高。與C組比較，第6、8周T組大鼠死亡率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。T組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)全程均無死亡。

表2 STZ注射后各組大鼠成模率和死亡率比較

*P<0.01，與相應(yīng)對(duì)照組比較；#P<0.01，與4周C組比較；△P<0.01，與6周C組比較。

2.3 實(shí)驗(yàn)大鼠胰腺、肝臟組織病理學(xué)改變

實(shí)驗(yàn)復(fù)制的2型糖尿病模型大鼠，胰腺組織病理切片觀察，鏡下胰島少見，形態(tài)不規(guī)則，邊緣不整齊，胰島中內(nèi)分泌細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞界限不清，個(gè)別胰島內(nèi)呈空泡樣改變(圖1，T組取材)。肝細(xì)胞疏松，脂肪樣變性及灶性壞死，匯管區(qū)及肝竇可見炎細(xì)胞浸潤，肝索排列紊亂，肝竇變窄(圖2，T組取材)。

3 討論

創(chuàng)建一種經(jīng)濟(jì)適用、穩(wěn)定性好、重復(fù)率高、遠(yuǎn)期死亡率低的糖尿病造模方法對(duì)糖尿病研究具有重大而現(xiàn)實(shí)的意義[9-10]。近年來，國內(nèi)外對(duì)糖尿病動(dòng)物模型的研究十分活躍，使用高脂誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生胰島素抵抗，再用小劑量STZ選擇性損傷大鼠部分胰島B細(xì)胞，使胰島素合成相對(duì)減少的造模方法被廣泛采用[11-12]。但是，這種造模方法在STZ的用量與用法上，動(dòng)物成模率與穩(wěn)定性等方面各研究者的報(bào)道差別很大。2008年劉亞平等[13]報(bào)道，STZ 30 mg/kg，3周后再次注射30 mg/kg；2009年王玉忠等[14]報(bào)道，STZ 30 mg/(kg·d)，連續(xù)3 d注射；2011年申彥菊等[15]報(bào)道，STZ 30 mg/(kg·d)，連續(xù)5 d注射；2011年王嘉惠等[16]報(bào)道，STZ 45 mg/kg；2012年薛紅麗等[17]報(bào)道，STZ 35 mg/kg。在STZ單次用量上，從15 mg/kg至45 mg/kg均有報(bào)道，一次模型復(fù)制總用量從15 mg/kg至150 mg/kg均有報(bào)道，成模率報(bào)道從50%至80%不等。

實(shí)驗(yàn)中C組大鼠采用我們以往的2型糖尿病復(fù)制方法[18]，T組大鼠采用高脂+戊巴比妥鈉+STZ的方法復(fù)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，T組大鼠在STZ注射后第2周開始血糖平均水平就顯著高于C組大鼠，成模率也比C組大鼠高15%，提示該方法可能縮短成模周期。兩組大鼠都在STZ注射后第4周成模率達(dá)到高峰，但T組大鼠成模率高達(dá)90%，顯著高于C組的60%。STZ注射4周后C組大鼠成模率明顯下降，部分大鼠由于血糖水平太高，造成糖尿病酮癥酸中毒死亡，部分大鼠血糖水平發(fā)生自然恢復(fù)，而T組大鼠成模率無明顯下降，說明在模型穩(wěn)定性方面，T組大鼠要高于C組大鼠。從結(jié)果中的表1看，C組大鼠血糖平均水平的標(biāo)準(zhǔn)差明顯高于T組大鼠，說明T組大鼠組內(nèi)血糖差異度要小于C組大鼠。對(duì)T組實(shí)驗(yàn)大鼠胰島與肝臟組織進(jìn)行病理學(xué)觀察，低倍鏡下胰島分布少見，形態(tài)與邊緣改變，高倍鏡下島內(nèi)細(xì)胞數(shù)量下降，個(gè)別甚至呈空泡樣改變；肝細(xì)胞疏松，脂肪樣變性，匯管區(qū)及肝竇炎性病變。這些病理變化也與糖尿病病理吻合，進(jìn)一步證明了模型的可靠性。

從上述結(jié)果分析，“高脂飲食+戊巴比妥鈉+小劑量STZ”的2型糖尿病造模方法，與目前研究者廣泛采用的“高脂飲食+小劑量STZ”的造模方法比較，相對(duì)優(yōu)勢(shì)為：大幅提高了造模成功率，降低了造模成本，縮小糖尿病模型個(gè)體之間的病理差異，提高模型的穩(wěn)定性，降低后期轉(zhuǎn)陰率和死亡率，使模型更接近于人類糖尿病的病生病理。戊巴比妥鈉在新的造模方法中可能具有以下一些作用：(1)改變了給藥方法，由單一給藥改為聯(lián)合給藥，通過協(xié)同效應(yīng)增強(qiáng)藥物的作用效果，降低了STZ用量；(2)統(tǒng)一給藥后狀態(tài)，由活動(dòng)狀態(tài)給藥改為麻醉狀態(tài)給藥，統(tǒng)一了STZ作用時(shí)的動(dòng)物機(jī)能狀態(tài)，縮小了模型之間的病理差異；(3)降低了STZ作用時(shí)動(dòng)物的機(jī)能，延緩了STZ的代謝，從而增加了STZ的有效作用時(shí)間。

【參考文獻(xiàn)】

[1]Yang W,Lu J,Weng J,et al.Prevalence of diabetes among men and women in China[J].N Engl J Med,2010,362(12):1090-1101.

[2]王海鵬.我國診斷糖尿病疾病經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)趨勢(shì)預(yù)測(cè)研究[D].山東：山東大學(xué),2013.

[3]吳 晏,韓 靜,黃黎明,等.高脂喂養(yǎng)合并小劑量鏈脲佐菌素建立2型糖尿病大鼠模型[J].中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào),2012,20(2):11-15.

[4]向雪松,王 竹,祝宇銘,等.鏈脲佐菌素注射劑量對(duì)建立2型糖尿病大鼠模型的影響[J].衛(wèi)生研究,2010,39(2):138-142.

[5]鄭 倩,劉 紅,陳武寧,等.果糖二磷酸鈉對(duì)2型糖尿病大鼠周圍神經(jīng)傳導(dǎo)功能的影響[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2011,13(11):72-74.

[6]劉 紅,蘭海濤,陳武寧,等.歸芪合劑對(duì)糖尿病大鼠尾神經(jīng)傳導(dǎo)的影響[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2014,25(2):309-310.

[7]郭嘯華,劉志紅,李 恒,等.實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠模型的建立[J].腎臟病與透析腎移植雜志，2000,9(4):351-355.

[8]張汝學(xué),賈正平,王 娟,等.實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠模型的建立和評(píng)價(jià)(Ⅰ)—體重、血糖和肝糖原的變化[J].西北國防醫(yī)學(xué)雜志,2007,28(3):161-163.

[9]沈亞非,徐焱成.高糖高脂膳食和鏈尿佐菌素誘導(dǎo)2型糖尿病模型的建立[J].實(shí)用診斷與治療雜志,2006,20(9):649-650.

[10]劉科宇,王春華,杜智敏.鏈脲佐菌素致大鼠高血糖模型的實(shí)驗(yàn)研究[J].哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2006,40(4):272-274.

[11]何清華,周迎生,王 征,等.2型糖尿病大鼠模型制備的影響因素及其特點(diǎn)[J].中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào),2007,15(6):425-429.

[12]王春田,王 莉,石 巖.2型糖尿病動(dòng)物模型制備方法探討[J].實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志,2011,25(4):27-30.

[13]劉亞平,季 虹,榮海欽,等.不同性別大鼠在2型糖尿病造模過程中的穩(wěn)定性[J].中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào),2008,16(1):52-55.

[14]王玉忠,張志國,孫朝輝,等.2型糖尿病大鼠模型的建立與評(píng)價(jià)[J].毒理學(xué)雜志,2009,23(6):476-478.

[15]申彥菊,彭 嵐,廖芝玲,等.STZ復(fù)制實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠模型過程及經(jīng)驗(yàn)總結(jié)[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2011,28(6):821-823.

[16]王嘉惠,沈小玲,符崇威,等.高脂喂養(yǎng)聯(lián)合鏈脲佐菌素誘導(dǎo)大鼠2型糖尿病模型研究[J].吉林醫(yī)學(xué),2011,32(4):629-633.

[17]薛紅麗,張 曾,王文健,等.實(shí)驗(yàn)性胰島素抵抗糖尿病大鼠生物學(xué)特征[J].上海醫(yī)學(xué),2012,35(1):37-40.

[18]鄭 倩,劉 紅,劉 華,等.果糖二磷酸鈉對(duì)2型糖尿病大鼠胰島內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)CHOP和JNK表達(dá)及胰島細(xì)胞凋亡的影響[J].中國病理生理雜志,2012,28(4):733-737.