兩株糞腸球菌的安全性評價

王雪芹，林海君，鞠世影，霍貴成（東北農(nóng)業(yè)大學，乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱150030）

兩株糞腸球菌的安全性評價

王雪芹，林海君，鞠世影，霍貴成*（東北農(nóng)業(yè)大學，乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱150030）

乳酸菌KLDS6.0610和KLDS6.0611是兩株分離于傳統(tǒng)乳制品的糞腸球菌，這兩株菌均會產(chǎn)生高效抗李斯特菌的細菌素，而且產(chǎn)生的細菌素具有良好的加工穩(wěn)定性。本實驗主要是評價這兩株菌的安全性，為其實際應用提供可靠的理論依據(jù)。通過對兩株菌的耐藥性、有害代謝產(chǎn)物、機體指標、急性毒理實驗以及溶血性和易位實驗得到：急性毒理實驗中，動物的體重變化正常而且主要臟器無異常；兩株菌對大部分常見的抗生素都沒有耐藥性，只是對慶大霉素具有抗性，不含有可轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒；而且菌株的生長代謝過程中不會產(chǎn)生硝基還原酶、膽鹽羧化酶和氨基脫羧酶；谷胱甘肽和丙二醛含量基本正常，不會產(chǎn)生溶血和易位現(xiàn)象。通過對兩株菌的安全性評價可知乳酸菌KLDS6.0610和KLDS6.0611是安全的。

糞腸球菌，安全性，耐藥性，機體指標

乳酸菌是一群能使可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽性細菌的統(tǒng)稱[1]，乳酸菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、增強機體免疫、促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收和益生等功能，所以廣泛應用于乳制品、保健品和添加劑中而被人們所消費。通常使用的乳酸菌被認為是人體腸道的重要菌群，對人體是無害的[2]，但是乳酸菌的安全問題仍不容忽視，尤其是一些沒有長時間安全使用歷史的新開發(fā)菌株，應確保其安全性再投入到實際應用中。

現(xiàn)階段，我國還沒有完善的乳酸菌及其產(chǎn)品的安全性評價方法和體系，一般都是從耐藥性評價、有害代謝產(chǎn)物評價和動物性實驗幾個方面進行菌株的安全性評估[3]。本實驗的兩株乳酸菌KLDS6.0610和KLDS6.0611均分離于傳統(tǒng)的乳制品中，通過電鏡觀察和16SrDNA的鑒定，兩株均為糞腸球菌[4]。KLDS6.0610和KLDS6.0611是兩株高產(chǎn)高效抗李斯特菌細菌素的乳酸菌，而且產(chǎn)生的細菌素有良好的加工穩(wěn)定性，具有潛在的應用價值和前景[4]。本實驗對兩株糞腸球菌進行耐藥性實驗、機體指標和有害代謝產(chǎn)物的評價實驗以及急性毒理實驗，評價這兩株菌的安全性，為其以后的實際應用提供理論的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳酸菌KLDS6.0610和KLDS6.0611 由乳品科學教育部重點實驗室工業(yè)微生物菌種保藏中心（KLDSDICC）提供；清潔級昆明雄性小鼠 由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供，許可證號scxk2011-027，平均體重為12～16g；BASM培養(yǎng)基 配方見文獻[5]；MRS培養(yǎng)基 配方見文獻[4]；蛋白胨、酵母膏、多價胨、牛肉膏、胰蛋白胨、北京奧博星；瓊脂糖、葡萄糖、吐溫80、氯化鈉 北京博奧拓達；酪氨酸、組氨酸、賴氨酸 天津TBD公司；藥敏紙片 杭州微生物試劑有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、丙二醛測定試劑盒，BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒 碧云天試劑有限公司；硝基還原酶測試盒、還原型谷胱甘肽檢測試劑盒 南京建成試劑有限公司。

電熱恒溫培養(yǎng)箱DHP-9272 上海-恒科技有限公司；全自動高壓滅菌鍋HVE-50HIRAYAMA；DK-98-11A電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱DH-101-3BS 天津市中環(huán)實驗電爐有限公司；快速混勻器XK96-A、勻漿器 姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司；紫外分光光度儀、酶標儀 美國Beckman公司；潔凈工作臺VD-1320 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；低速離心機LD4-2 北京醫(yī)用離心機。

1.2 實驗方法

1.2.1 耐藥性評價實驗

1.2.1.1 藥敏片實驗 采用藥敏片瓊脂擴散法[6]。將待測菌液培養(yǎng)過夜，取100μL待試菌液均勻涂布于MRS固體培養(yǎng)基中，菌液完全被吸收后，然后把藥敏片放入每個MRS培養(yǎng)基中，所用的藥敏片分別為：萬古霉素、卡那霉素、四環(huán)素、氨芐青霉素、氯霉素、青霉素和慶大霉素。靜置20min后，放入37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，24h后測量各藥敏片的抑菌圈大小。

1.2.1.2 質(zhì)粒提取實驗 取1.5mL培養(yǎng)14h的實驗菌液，用質(zhì)粒提取試劑盒采用可以特異性結合DNA的離心吸附柱和獨特的緩沖液系統(tǒng)提取菌液的基因組DNA。將0.5g瓊脂糖溶解于100mL的1×TAE電泳緩沖液中，冷卻至室溫，并向其中加入0.5μL溴乙錠，倒入電泳槽中制備電泳所用的膠。將4μL提取完質(zhì)粒的液體與2μL的6×Buffer混合，向瓊脂糖凝膠中點樣。電壓為150V，工作時間為20min。電泳液為1×TAE溶液，電泳結束后，使用凝膠成像儀進行觀察。

1.2.2 有害代謝產(chǎn)物評價實驗

1.2.2.1 硝基還原酶檢測實驗 將培養(yǎng)14h的實驗菌液3000r/min離心20min，吸取上層清液，使用硝基還原酶測試盒測定待測菌液中硝基還原酶的濃度。硝基還原酶檢測方法各管試劑添加順序見表1，添加完成后混勻，3500r/min離心10min，取上清，于540nm處測定吸光值。

表1 硝基還原酶檢測方法Table 1 The test method of nitrate reductase

1.2.2.2 氨基脫羧酶活性檢測實驗 使用渦旋混勻器將過夜培養(yǎng)的實驗菌液混合均勻，取100μL菌液均勻涂布于BASM培養(yǎng)基中，菌液完全吸收后，放入37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，24h后觀察菌落周圍是否有顏色變化。

1.2.3 動物實驗

1.2.3.1 適應性喂養(yǎng) 在環(huán)境為20℃，濕度為50%，光照12h的條件下，給予足夠的食物和純凈水進行喂養(yǎng)3～5d。

1.2.3.2 急性毒理實驗 將結束了適應性喂養(yǎng)的清潔級昆明雄性小鼠隨機分成四組，每組5只。分別編號為KLDS6.0610對照組、KLDS6.0610實驗組、KLDS6.0611對照組和KLDS6.0611實驗組。將過夜培養(yǎng)的菌液濃度調(diào)至109cfu/0.2mL 0.9%NaCl溶液，灌胃開始前16h禁食，但不限制飲水。按每只0.2mL/10g體重的劑量進行灌胃，一日三次，每次間隔2～3h。灌胃結束后，觀察7日內(nèi)小鼠的活動狀態(tài)和體重變化，第8d將全部的小鼠用頸椎脫臼法處死，觀察主要器官的變化。

1.2.4 主要機體指標評價實驗

1.2.4.1 丙二醛血清（MDA）濃度檢測實驗和肝總谷胱甘肽（GSH）濃度檢測實驗 將結束了適應性喂養(yǎng)的20只昆明雄性小鼠隨機分成4組，每組5只。別為KLDS6.0610對照組、KLDS6.0610實驗組、KLDS6.0611對照組和KLDS6.0611實驗組。實驗組的菌液濃度為109cfu/0.2mL 0.9%NaCl溶液，對照組使用0.9%NaCl溶液進行灌胃，劑量均為0.2mL/10g，每天一次，連續(xù)20d。在第21d時，對全部的小鼠進行眼球取血，3000r/min離心20min，吸取上層清液，使用丙二醛測定試劑盒進行丙二醛含量的測定。同時，將小鼠處死，稱取0.1g肝臟溶于1mL 0.9%NaCl溶液中，在冰水浴的條件下進勻漿，然后3000r/min離心20min，吸取上層清液，使用BCA蛋白質(zhì)試劑盒和谷胱甘肽濃度檢測試劑盒檢測肝總谷胱甘肽的濃度。

1.2.4.2 膽鹽羧化酶活性的檢測 普通的MRS固體培養(yǎng)基中加入5g牛黃脫氧膽酸鈉鹽，121℃15min滅菌后，傾倒于平板中，將待測菌液均勻涂布于平板中，放入37℃培養(yǎng)箱中，24h后觀察是否有白色沉淀產(chǎn)生。

1.2.5 其他評價實驗

1.2.5.1 溶血實驗 菌株KLDS6.0610和KLDS6.0611在MRS中37℃培養(yǎng)14h，然后轉(zhuǎn)移到血瓊脂基質(zhì)平板上。平板在37℃培養(yǎng)14h。通過觀察菌落周圍是否有清晰的溶菌圈，記錄溶血反應結果。

1.2.5.2 易位實驗 將結束了適應性喂養(yǎng)的20只昆明雄性小鼠隨機分成4組，每組5只。分別為KLDS6.0610對照組、KLDS6.0610實驗組、KLDS6.0611對照組和KLDS6.0611實驗組。實驗組的菌液濃度為109cfu/0.2mL 0.9%NaCl溶液，對照組使用0.9%NaCl溶液進行灌胃，劑量均為0.2mL/10g，每天一次，連續(xù)10d。每天記錄小鼠的體重變化，在第11d，稱取1g處死小鼠的心、肝、脾、肺、腎，并加入9mL的生理鹽水在冰水浴的條件下進行勻漿，制備成10%的勻漿液。并將勻漿液均勻涂布于MRS培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)24h后，觀察平板上是否有菌落生長。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行差異性分析。數(shù)據(jù)的表示方式為：平均值±標準偏差。相同字母代表差異性不顯著，不同字母代表差異性顯著。

2 實驗結果

2.1 耐藥性評價實驗

耐藥性實驗結果見表2。通過KLDS6.0610和KLDS6.0611對7種常見抗生素的敏感性實驗可知，兩株菌對大部分抗生素都很敏感，沒有抗藥性，但是對慶大霉素不敏感。瓊脂糖凝膠電泳實驗結果見圖1，兩株菌的泳道均沒有條帶，可以判定KLDS6.0610和KLDS6.0611都沒有質(zhì)粒存在。

表2 耐藥性實驗結果Table 2 The results of resistance test

圖1 質(zhì)粒提取的電泳圖Fig.1 Electrophoregram of plasmid extractio

2.2 有害代謝產(chǎn)物評價實驗

氨基脫羧酶檢測實驗結果見表3，兩株菌均表現(xiàn)出陰性反應，可以認定KLDS6.0610和KLDS6.0611均不含有氨基脫羧酶。硝基還原酶濃度檢測實驗結果見表4，KLDS6.0610和KLDS6.0611中硝酸還原酶的濃度與對照組無顯著差異性，所以可以判定兩株菌中均沒有硝基還原酶的存在。

表3 氨基脫羧酶檢測結果Table 3 The detection results of amino acid decarboxylase

表4 硝基還原酶檢測結果Table 4 The test results of nitrate reductase

2.3 急性毒理實驗

灌胃結束的7d內(nèi)，小鼠的活動正常，無異常行為，進食和飲水正常，皮毛正常，而且實驗組的小鼠體重呈現(xiàn)正常的增長趨勢，與對照組無顯著差異性（見圖2）。在第8d時對小鼠進行解刨，觀察到實驗組小鼠的心、肝、脾、肺、腎均無異?，F(xiàn)象。

圖2 動物的體重變化Fig.2 The weight change of animals

2.4 主要機體指標評價實驗

在20d的灌胃期間內(nèi)，沒有小鼠出現(xiàn)死亡的現(xiàn)象，而且小鼠的進食、飲水和排便均正常，精神狀態(tài)良好，活動正常，通過對實驗組和對照組的小鼠體重進行差異性分析可知，實驗組小鼠的體重也與對照組一樣呈現(xiàn)正常增長趨勢，無顯著差異（見表5）。

GSH和MDA的檢測結果見圖3～圖4。實驗組的丙二醛濃度與對照組無顯著差異（p＞0.05），而谷胱甘肽的含量顯著高于對照組（p＜0.05）。將兩株菌分別涂在含有牛黃脫氧膽酸耐鹽的MRS上培養(yǎng)24h后發(fā)現(xiàn)沒有白色沉淀產(chǎn)生，說明兩株菌都不含有牛黃脫氧膽酸鈉鹽。

表5 動物的體重（g）變化結果（x±SD；n=5）Table 5 The results of weight（g）change of animals（x±SD；n=5）

圖3 GSH的檢測結果Fig.3 The detection results of content of GSH

圖4 MDA的檢測結果Fig.4 The detection results of content of MDA

2.5 其他評價實驗

KLDS6.0610和KLDS6.0611均沒有出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，在易位實驗的10d灌胃期間內(nèi)，小鼠的體重無異常變化（見表6），而且處死小鼠的心、肝、脾、肺、腎勻漿處理后涂布在MRS培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)的結果顯示：沒有出現(xiàn)乳酸菌生長的現(xiàn)象，所以沒有發(fā)生細菌的易位現(xiàn)象。

表6 易位實驗動物體重（g）變化結果（x±SD；n=5）Table 6 The weight（g）change of animals translocation experiment（x±SD；n=5）

3 討論

3.1 耐藥性評價實驗

近年來，隨著抗生素的廣泛使用，乳酸菌也不斷出現(xiàn)耐藥性的現(xiàn)象，特別是有些乳酸菌對萬古霉素的耐藥性為臨床治療帶來了很大的困難[7]。乳酸菌的耐藥性主要來自于兩個原因：乳酸菌自身具有編碼耐藥性的基因，這個基因可能位于染色體上，也可能位于質(zhì)粒上?；蛘呤峭ㄟ^基因水平轉(zhuǎn)移獲得耐藥因子，長期攝入具有耐藥性的乳酸菌會對人的身體產(chǎn)生嚴重的危害[8]。

通過藥敏實驗可知：KLDS6.0610和KLDS6.0611均對萬古霉素、卡那霉素、四環(huán)素、氨芐青霉素、氯霉素、青霉素很敏感，只是對慶大霉素具有抗性。說明兩株菌有潛在的應用前景。在質(zhì)粒檢測實驗中發(fā)現(xiàn)，兩株菌均不含有質(zhì)粒，這有可能是因為兩株菌并不含有耐藥基因，或者是耐藥基因存在于染色體上，但是可以判定在這兩種情況下，兩株菌都不會通過基因水平轉(zhuǎn)移將耐藥基因轉(zhuǎn)移，在實際應用中應該是安全。

3.2 機體指標評價實驗

體重異常是引起各種疾病的一個異常前兆，在20d的灌胃期間內(nèi)。實驗組的小鼠體重增長正常，精神狀態(tài)良好，無死亡現(xiàn)象。說明KLDS6.0610和KLDS6.0611的攝入不會引起小鼠體重的異常變化，降低各種疾病的發(fā)病率。

谷胱甘肽在動物的肝臟中含量較為豐富，具有保護肝臟的功能[9]，實驗中發(fā)現(xiàn)實驗組小鼠的谷胱甘肽含量略高于對照組，可能與敗血癥急性期有關系，但是，對機體沒有明顯的影響。脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應會產(chǎn)生丙二醛，丙二醛會引起蛋白質(zhì)、核酸等大分子的交聯(lián)，具有細胞毒性[9]。實驗中檢測到實驗組與對照組的血清丙二醛濃度沒有明顯差異，說明KLDS6.0610和KLDS6.0611并沒有增加脂類超氧化能力，避免了細胞毒性的產(chǎn)生。

3.3 有害代謝產(chǎn)物評價實驗

硝基還原酶可以將人體內(nèi)攝入的硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，并在一定的條件下產(chǎn)生硝酸銨，對人體具有致癌變的危害[10]。氨基脫羧酶能夠?qū)⑹称分械陌被崦擊冗€原成生物胺類物質(zhì)[11]，當體內(nèi)積累過多的生物胺類物質(zhì)時，機體會產(chǎn)生嚴重的中毒癥狀。KLDS6.0610和KLDS6.0611均不含有硝基還原酶和氨基脫羧酶，可以應用于實際生產(chǎn)中。

3.4 其他評價實驗

溶血性細菌的侵入引起的溶血現(xiàn)象會導致敗血癥的發(fā)生，實驗證實KLDS6.0610和KLDS6.0611不會引起溶血現(xiàn)象，對紅細胞沒有影響。細菌易位是腸道內(nèi)的細菌越過腸粘膜屏障，出現(xiàn)在其他臟器的一種現(xiàn)象，這種腸道微生態(tài)被嚴重破壞后會對機體造成不良的影響，易位實驗結果表明：KLDS6.0610和KLDS6.0611均不會在小鼠體內(nèi)發(fā)生易位現(xiàn)象。

4 結論

通過對兩株高產(chǎn)細菌素的糞腸球菌進行全面的安全性評價可知：兩株菌對大部分常見的抗生素均無抗性，只是對慶大霉素有抗性，不含有可轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒。不會產(chǎn)生硝基還原酶、膽鹽羧化酶和氨基脫羧酶。急性毒理實驗可知：實驗組的動物體重與對照組無顯著差異性，主要器官無異常變化。動物喂養(yǎng)實驗可知：谷胱甘肽和丙二醛的含量基本正常，不會產(chǎn)生溶血和易位現(xiàn)象。所以，乳酸菌KLDS6.0610和KLDS6.0611是安全的。

[1]楊潔彬，郭興華.乳酸菌-生物學基礎及應用[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，1996.

[2]劉勇，張勇.世界益生菌安全性評價方法[J].中國食品學報，2011，11（6）：142-150.

[3]貢漢生，孟祥晨.益生菌的安全性評價[J].現(xiàn)在食品科技，2011，86（4）：76-79.

[4]于凱慧.產(chǎn)抗李斯特菌細菌素乳酸菌的篩選與鑒定[J].食品科技，2011，36（5）：2-7.

[5]BOVER-CID S，HOLZAPFEL W H.Improved screening procedure for biogenic amine production by lactic acid bacteria [J].Int J Food Microbiol，1999，53（1）：33-41.

[6]柳翰凌.內(nèi)蒙古牧區(qū)傳統(tǒng)乳制品中乳桿菌降膽固醇特性的研究[D].呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學，2006.

[7]Ogier，serror.Safety assessment of dairy microorganisms and the Enterococcus genus[J].International Journal of Food Microbiology，2008，126：291-301.

[8]W ITTE W.Impact of antibiotic use in animal feeding on resistance of bacterial pathogens in humans[C].In：CHADW ICK D J GOODE J，Antibiotic resistance origins.evolution，selection，and spread，Ciba Foundation Symposium 207.Chichester：Wiley，1997：61-75.

[9]LARA-VILLOSLADA F，SIERRA S.Safety assessment of Lactobacillus feimentum CECT5716，a probiotic strain isolated from human milk[J].J Dairy Res，2009，76（2）：216-221.

[10]MARINPM，MAIFRENIM，BARTOLOMELII，et al.Evaluation of amino acid decarboxylase microbiota through out the ripening of an Italian PDO cheese produced using different manufacturing practices[J].J Appl Microbiol，2008，105（2）：540-549.

[11]GONZLEZ de LLANOD，CUESTAP，RODRIGUEZA.Biogenic amine production by wild lactococal and leuconostoc stains[J]. Lett Appl Microbiol，1998，26（4）：270-274.

Safe assessment of two Enterococcus faecalis

WANG Xue-qin，LIN Hai-jun，JU Shi-ying，HUO Gui-cheng*
（Northeast Agriculture University，Key Laboratory of Dairy Science，Ministry of Education，Harbin 150030，China）

Two Enterococcus faecalis coded as KLDS6.0610 and KLDS6.0611 were separated from traditional dairy.They could produce bacteriocins active against L.monocytogenes and had good stability in the processing.The objective of the present study was to evaluate the safety of the Enterococci.In the acute toxicology experiment，the weight changes of animals was normal.Two strains did not present multi-resistance to antibiotics and had no transferable plasmid.They did not produce nitrate reductase，bile acid carboxylase and amino acid decarboxylase.The content of GSH and MDA were normal.They had no hemolytic activity and translocation phenomenon.So，both KLDS6.0610 and KLDS6.0611 were safe.

Enterococci faecalis；safety；drug resistance；body index

TS201.1

A

1002-0306（2014）08-0166-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.029

2013－08－05 *通訊聯(lián)系人

王雪芹（1989-），女，碩士研究生，研究方向：乳品科學與微生物。

國家“863”項目（2011AA100902）。