非小細(xì)胞肺癌吉西他濱化療敏感性預(yù)測

吳 鵬 徐佳佳 王國慶 馮俊志 施 風(fēng)

1.江蘇建康職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)護理系，江蘇南京211800；2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院病理科，江蘇南京210009

非小細(xì)胞肺癌吉西他濱化療敏感性預(yù)測

吳 鵬1徐佳佳2王國慶2馮俊志1施 風(fēng)1

1.江蘇建康職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)護理系，江蘇南京211800；2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院病理科，江蘇南京210009

目的探討非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）吉西他濱（GEM）化療敏感性預(yù)測靶標(biāo)。方法30例NSCLC組織，體外藥敏試驗明確GEM IC50值；Realtime-PCR檢測GEM代謝酶hENT1、dCK、RRM1和RRM2mRNA表達(dá)水平。結(jié)果hENT1、dCK、RRM1和RRM2單個基因表達(dá)量與GEM IC50值無關(guān)（P＞0.05）；（hENT1×dCK）/（RRM1×RRM2）值與GEM IC50值呈負(fù)相關(guān)（P＜0.001）。結(jié)論（hENT1×dCK）/（RRM1×RRM2）值可作為GEM化療敏感性預(yù)測的潛在標(biāo)志物。

非小細(xì)胞肺癌；吉西他濱；化療敏感性；原代細(xì)胞

非小細(xì)胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌80%以上，大多數(shù)患者在初診時即有局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，手術(shù)的機會受到限制，因此化療仍是NSCLC臨床治療的重要手段。吉西他濱（Gemcitabine，GEM）是新一代阿糖胞苷類似物，屬抗代謝類抗腫瘤藥[1]，臨床上一線應(yīng)用于NSCLC、胰腺癌、進展期膀胱癌和蒽環(huán)類失敗的轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療[2]，但GEM的原發(fā)性與繼發(fā)性耐藥使其臨床應(yīng)用受到限制，目前尚缺乏較為有效指標(biāo)來預(yù)測腫瘤細(xì)胞對此藥物的敏感性。多個關(guān)鍵酶參與GEM在體內(nèi)的代謝調(diào)節(jié)，這些關(guān)鍵酶的表達(dá)水平可能直接影響到機體對GEM的藥物敏感性[3]。本實驗擬在NSCLC標(biāo)本中檢測GEM代謝酶hENT1、dCK、RRM1和RRM2mRNA表達(dá)水平，通過體外藥敏試驗分析其與GEM化療敏感性的關(guān)系，明確其指導(dǎo)NSCLC個體化治療的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

30例初治NSCLC患者的術(shù)后組織標(biāo)本源自2012年1月～2012年6月于江蘇省腫瘤醫(yī)院和東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院胸外科住院患者，標(biāo)本離體30 min內(nèi)無菌收集，每份標(biāo)本一分為二，一份用于體外藥敏試驗，一份用于基因表達(dá)檢測。所有患者均經(jīng)病理檢查確診。標(biāo)本采集經(jīng)患者知情同意并得到醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 體外藥敏試驗

取新鮮癌組織約1 g（1 cm3），用Hank's液反復(fù)沖洗，洗去血細(xì)胞并盡量剔除其中的黑色顆粒物及非癌組織，機械法制成單細(xì)胞懸液[4]。臺盼藍(lán)染色計數(shù)活細(xì)胞數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為（2～5）×105/m L。取GEM濃度序列為0、1.0、5、10、20、40、80、160、320、640μmol/L。將上述單細(xì)胞懸液接種于96孔板（4000個/孔），每個濃度設(shè)3個平行實驗孔。待細(xì)胞貼壁后分別加入含GEM相應(yīng)濃度的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h。空白孔和對照孔為減除背景用。采用MTT法測定細(xì)胞生存率，檢測波長492 nm。細(xì)胞生存率=光密度（實驗孔-空白對照）/光密度（正常對照-空白對照）。實驗重復(fù)3次。用Graphpad Prism 5.0軟件繪制各組細(xì)胞對GEM的量效曲線并計算IC50。

1.3 Realtime-PCR

采用Trizol（美國Invitrogen公司）一步法提取癌組織總RNA，紫外分光光度計定量，取2μg RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（1st Strand cDNA Synthesis Kit，Takara公司，大連）。Rrealtime PCR反應(yīng)體系依照Takara公司SYBR premix ExTaqTM試劑盒說明配置。利用ABI7300儀器對hENT1、dCK、RRM1和RRM2 mRNA表達(dá)進行檢測，β-actin作為內(nèi)參。引物序列和退火溫度見表1。上機反應(yīng)條件為：變性95℃，15 s；退火56～60℃，30 s；延伸72℃，30 s，45個循環(huán)。每個實驗組行兩次以上有效重復(fù)，平行做目的基因和內(nèi)參基因，每個反應(yīng)做3個完全一致的PCR儀器孔重復(fù)。目的基因的mRNA相對表達(dá)量用2-ΔΔCt法分析。

表1 引物序列及產(chǎn)物長度

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，基因表達(dá)與GEM化療敏感性的關(guān)系采用Spearman相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原代腫瘤細(xì)胞生長狀況及形態(tài)學(xué)表現(xiàn)

NSCLC原代細(xì)胞培養(yǎng)30例均成功，傳3～5代后仍保持穩(wěn)定。細(xì)胞呈貼壁生長，形態(tài)各異，呈梭形、三角形、多角形等，細(xì)胞輪廓清楚，胞漿均質(zhì)透明，核圓形，單核或多核。見圖1。

圖1 非小細(xì)胞肺癌原代細(xì)胞培養(yǎng)

2.2 代謝酶表達(dá)與GEM化療敏感性

NSCLC原代細(xì)胞對GEM的IC50值為10～400μmol/L。計算每例標(biāo)本的hENT1、dCK、RRM1和RRM2相對表達(dá)量，與該例標(biāo)本的IC50值進行相關(guān)性分析，可見hENT1和dCK表達(dá)量與IC50值有負(fù)相關(guān)的趨勢，RRM1和RRM2表達(dá)量與IC50值有正相關(guān)的趨勢，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。然而，（hENT1×dCK）/（RRM1×RRM2）與吉西他濱的IC50值呈負(fù)相關(guān)（r= -0.851，P＜0.001）。見圖2。

圖2 代謝酶表達(dá)與GEM IC50的關(guān)系

3 討論

原代腫瘤細(xì)胞因剛從組織中分離，生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化，仍保留原來的遺傳學(xué)特性，也最接近體內(nèi)細(xì)胞生長特性，是理想的基因表達(dá)和藥物毒性實驗對象。本實驗培養(yǎng)的原代NSCLC細(xì)胞不排除混雜有部分成纖維細(xì)胞等腫瘤間質(zhì)細(xì)胞，考慮到腫瘤間質(zhì)成分對化療耐藥也具有重要意義，尚有部分體外藥敏試驗采用腫瘤組織塊培養(yǎng)法進行[5]，因此未作進一步分離、鑒定。

GEM系胞嘧啶核苷衍生物，主要通過人平衡型核苷載體1（human equilibrative nucleoside transporters 1，hENT1）和濃度型核苷載體（human concentrative nucleoside transporters 1，hCNT1）進入細(xì)胞，在胞漿內(nèi)，GEM被脫氧胞苷激酶（deoxycytidine kinase，dCK）磷酸化為雙氟脫氧胞苷一磷酸（difluorodeoxycytidine monophosphate，dFdCMP），后者繼續(xù)活化為雙氟脫氧胞苷二磷酸（dFdCDP）及雙氟脫氧胞苷三磷酸（dFdCTP）活性產(chǎn)物。dFdCDP抑制核苷酸還原酶（ribonucleotide reductase，RR）的活性，使細(xì)胞內(nèi)DNA合成與修復(fù)所必需的原料脫氧二磷酸核苷減少，從而進一步抑制DNA的合成；dFdCTP是一種DNA多聚酶抑制劑，抑制DNA鏈延長，使DNA復(fù)制提前終止，它的濃度增加還將抑制dCMP脫氨酶，減少dFdCMP代謝，使藥物活化增加，自我強化其細(xì)胞毒的作用[6]。

hENT1是GEM在細(xì)胞膜上的主要載體。體外研究表明，22株NSCLC細(xì)胞株中hENT1的表達(dá)水平與GEM的IC50值明顯相關(guān)，以腺苷轉(zhuǎn)運抑制劑處理細(xì)胞可降低其對GEM的敏感性[7]，說明hENT1對NSCLC細(xì)胞系的藥物敏感性具有重要作用。Oguri等[8]對24例NSCLC患者研究表明，hENT1表達(dá)與含有GEM化療的客觀緩解有關(guān)，7例hENT1不表達(dá)的患者對GEM化療無效。也有研究發(fā)現(xiàn)，hENT1mRNA高表達(dá)的NSCLC患者并不能從吉西他濱治療中獲益[9]。

dCK可催化多種特異性底物的磷酸化反應(yīng)，是重要的代謝調(diào)節(jié)酶，dCK活性降低或表達(dá)量減少可使細(xì)胞內(nèi)核苷酸庫平衡失調(diào)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對吉西他濱的耐藥。研究表明，以dCK的自然底物2'-脫氧胞苷酸處理胰腺癌和NSCLC細(xì)胞株，可降低GEM的細(xì)胞毒性[10]；通過RNAi下調(diào)dCK的表達(dá)導(dǎo)致胰腺癌對吉西他濱發(fā)生繼發(fā)耐藥現(xiàn)象[11]。Kroep等[12]對包括NSCLC在內(nèi)的7種不同腫瘤模型的研究發(fā)現(xiàn)，dCK蛋白表達(dá)和dCK酶的活性與吉西他濱的敏感性呈正相關(guān)。通過免疫組化分析44例胰腺癌組織中的dCK表達(dá)強度，發(fā)現(xiàn)dCK高水平組的總生存期明顯優(yōu)于dCK低水平組[13]。

RR是細(xì)胞內(nèi)唯一具有催化核糖核酸還原為脫氧核糖核酸功能的酶，在DNA合成與修復(fù)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。RR基因包含2個亞單位M1與M2，其中，RRM1亞基是吉西他濱作用的主要靶點。體外實驗顯示，RRM1的表達(dá)上調(diào)3倍，吉西他濱的IC50值上升8倍，RRM1的表達(dá)下調(diào)則出現(xiàn)相反的趨勢[14]。在GEM高度耐藥的胰腺癌細(xì)胞系MiaPaCa2-RG中通過RNAi下調(diào)RRM1的表達(dá)可提高其對GEM的敏感性；在18例GEM術(shù)后輔助治療的胰腺癌患者中，RRM1高表達(dá)者較低表達(dá)者預(yù)后更差（P=0.016）[15]。Rosell等[16]發(fā)現(xiàn)，100例以吉西他濱/順鉑方案進行化療的NSCLC患者，RRM1低表達(dá)的總生存期明顯高于高表達(dá)者，分別為13.7個月和3.6個月（P=0.009）。膽管癌細(xì)胞中，RRM1、RRM2表達(dá)與GEM的IC50值呈負(fù)相關(guān)，并且，RRM1低表達(dá)的膽管癌患者對GEM的治療有效性與總生存均優(yōu)于高表達(dá)者[17]。

由于GEM代謝過程中涉及多個關(guān)鍵代謝酶，所以，其藥理作用也必然同時受多因素的影響。在GEM的代謝路徑上，單一某個因素的升高或降低可能僅是其他因素障礙導(dǎo)致的代償結(jié)果。如Nakano等[18]報道，胰腺癌細(xì)胞系的獲得性耐藥與單一的GEM代謝酶hENT1、dCK、RRM1和RRM2 mRNA表達(dá)水平無關(guān)，而是取決于四個因子間的平衡，（hENT1×dCK）/（RRM1×RRM2）值與吉西他濱的IC50值呈反比。另一項研究在70例以吉西他濱為主化療的胰腺癌患者中檢測hENT1、dCK、CDA、RRM1和RRM2 mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)高dCK表達(dá)，低RRM2表達(dá)以及5個基因的綜合評分與患者無進展生存相關(guān)[19]。

本實驗發(fā)現(xiàn)，單個代謝酶基因表達(dá)量與原代NSCLC細(xì)胞GEM IC50值無關(guān)，但（hENT1×dCK）/（RRM1×RRM2）值與GEM IC50值呈負(fù)相關(guān)，可能作為GEM化療敏感性預(yù)測的潛在標(biāo)志物，值得臨床進一步關(guān)注。鑒于既往研究的NSCLC化療敏感性的靶標(biāo)仍未得到廣泛認(rèn)可[20]，本實驗結(jié)果可望為臨床指導(dǎo)NSCLC個體化化療提供新的思路。

[1]DanesiR，AltavillaG，GiovannettiE，etal.Pharmacogenomics of gemcitabine in non-small-cell lung cancer and other solid tumors[J].Pharmacogenomics，2009，10（1）：69-80.

[2]黃雙，孫圣坤，徐阿祥，等.吉西他濱聯(lián)合卡鉑治療局部浸潤性膀胱癌的療效分析[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2012，16（9）：89-90.

[3]陳瑩，錢曉萍，劉寶瑞.非小細(xì)胞肺癌吉西他濱藥物耐藥相關(guān)基因研究進展[J].中國肺癌雜志，2011，14（5）：421-428.

[4]劉敏，王朝暉，周桂蘭，等.體外腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)法對非小細(xì)胞肺癌化療藥物敏感性的研究[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2009，31（1）：64–66.

[5]毛德強，潘玲，戴勤弼，等.體外組織塊培養(yǎng)藥敏試驗指導(dǎo)下腦膠質(zhì)瘤化療的臨床療效分析[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2011，14（10）：3390-3392.

[6]DanesiR，AltavillaG，GiovannettiE，etal.Pharmacogenomics of gemcitabine in non-small-cell lung cancer and other solid tumors[J].Pharmacogenomics，2009，10（1）：69-80.

[7]Achiwa H，Oguri T，Sato S，etal.Determinants of sensitivity and resistance to gemcitabine：the roles of human equilibrative nucleoside transporter 1 and deoxycytidine kinase in non-small cell lung cancer[J].Cancer Sci，2004，95（9）：753-757.

[8]Oguri T，Achiwa H，Muramatsu H，et al.The absence of human equilibrative nucleoside transporter 1 expression predictsnonresponse to gemcitabine-containing chemotherapy in non-smallcell lung cancer[J].Cancer Lett，2007，256（1）：112-119.

[9]卞榮榮，錢曉萍，劉寶瑞，等.hENT1 mRNA表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌吉西他濱化療臨床預(yù)后的相關(guān)性[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2012，20（4）：718-721.

[10]Giovannetti E，Mey V，Danesi R，etal.Interaction between gemcitabine and topotecan in human non-small-cell lung cancer cells：effectson cell survival，cell cycle and pharmacogenetic profile[J].Br JCancer，2005，92（4）：681-689.

[11]Ohhashi S，Ohuchida K，Mizumoto K，et al.Downregulation of deoxycytidine kinase enhances acquired resistance to gemcitabine in pancreatic cancer[J].Anticancer Res，2008，28（4）：2205-2212.

[12]Kroep JR，LovesWJ，van der Wilt CL，et al.Pretreatment deoxycytidine kinase levels predict in vivo gemcitabine sensitivity[J].Mol Cancer Ther，2002，1（6）：371-376.

[13]Sebastiani V，Ricci F，Rubio-Viqueira B，et al.Immunohistochemical and genetic evaluation of deoxycytidine kinase in pancreatic cancer：relationship to molecular mechanisms of gemcitabine resistance and survival[J]. Clin Cancer Res，2006，12（8）：2492-2497.

[14]Bepler G，Kusmartseva I，Sharma S，et al.RRM1 modulated in vitro and in vivo efficacy of gemcitabine and platinum in non-small-cell lung cancer[J].JClin Oncol， 2006，24（29）：4731-4737.

[15]Nakahira S，Nakamori S，Tsujie M，et al.Involvement of ribonucleotide reductase M1 subunit overexpression in gemcitabine resistance of human pancreatic cancer[J]. Int JCancer，2007，120（6）：1355-1363.

[16]Rosell R，Danenberg KD，Alberola V，etal.Ribonucleotide reductase messenger RNA expression and survival in gemcitabine/cisplatin-treated advanced non-small cell lungcancerpatients[J].Clin CancerRes，2004，10（4）：1318-1325.

[17]Nakamura J，Kohya N，Kai K，etal.Ribonucleotide reductase subunit M1 assessed by quantitative double-fluorescence immunohistochemistry predicts the efficacy of gemcitabine in biliary tract carcinoma[J].Int JOncol，2010，37（4）：845-852.

[18]NakanoY，Tanno S，KoizumiK，etal.Gemcitabinechemoresistance and molecular markers associated with gemcitabine transport and metabolism in human pancreatic cancer cells[J].Br JCancer，2007，96（3）：457-463.

[19]Fujita H，Ohuchida K，Mizumoto K，et al.Gene expression levels as predictivemarkers of outcome in pancreatic cancer after gemcitabine-based adjuvant chemotherapy[J]. Neoplasia，2010，12（10）：807-817.

[20]楊惠夷，劉文超.基于基因檢測的非小細(xì)胞肺癌個體化治療的研究進展[J].中國腫瘤生物治療雜志，2013，20（4）：478-484.

Study of Gem citabine chemosensitivity prediction in non-small cell lung cancer

WU Peng1XU Jiajia2WANG Guoqing2FENG Junzhi1SHIFeng1
1.Department of Nursing,Jiangsu Jiankang Vocational College,Jiangsu Province,Nanjing 211800,China;2.Department of Pathology,Zhongda Hospital Affiliated to Southeast University,Jiangsu Province,Nanjing 210009,China

Objective To explore biomarker of Gemcitabine(GEM)chemosensitivity in non-small cell lung cancer (NSCLC).M ethods GEM IC50of 30 NSCLC tissueswere detected by susceptibility testing in vitro,mRNA expression of hENT1,dCK,RRM1 and RRM2 were determined by Realtime-PCR.Results hENT1,dCK,RRM1 or RRM2 expression levels in individual gene had no relationship with the GEM IC50value(P＞0.05),however,ratio of(hENT1×dCK)/ (RRM1×RRM2)was negatively correlated with GEM IC50value(P＜0.001).Conclusion Ratio of(hENT1×dCK)/ (RRM1×RRM2)may predict GEM chemosensitivity in NSCLC.

Non-small cell lung cancer;Gemcitabine;Chemosensitivity;Primary culture cell

R734.2；R730.54

A

1673-7210（2014）08（b）-0043-04

2014-05-06本文編輯：程銘）

江蘇建康職業(yè)學(xué)院院級教科研項目（編號JK20 1104）。

吳鵬（1978-），男，醫(yī)學(xué)碩士；研究方向：腫瘤學(xué)。