小分子NEK2干擾RNA 對肺癌細胞耐藥的研究

陳永鋒 王海晶 劉丁瑗 周向東

1.第二軍醫(yī)大學西南醫(yī)院呼吸科，重慶400038；2.解放軍75600部隊醫(yī)院接診室，廣東深圳518048

小分子NEK2干擾RNA 對肺癌細胞耐藥的研究

陳永鋒1，2王海晶1劉丁瑗1周向東1

1.第二軍醫(yī)大學西南醫(yī)院呼吸科，重慶400038；2.解放軍75600部隊醫(yī)院接診室，廣東深圳518048

目的探討小分子NEK2干擾RNA（siRNA-NEK2）逆轉(zhuǎn)人肺癌耐藥細胞（A549/DDP）耐藥性的研究。方法應用Real-time PCR法及Western blot法驗證NEK2基因在人肺腺癌耐藥細胞系（A549/DDP）細胞系呈現(xiàn)高表達；并采用脂質(zhì)體為轉(zhuǎn)染介質(zhì)，將NEK2小片段RNA導入A549/DDP細胞沉默NEK2基因；應用MTT法觀察順鉑、阿霉素對沉默NEK2基因后的A549/DDP細胞的細胞毒活性變化。結(jié)果NEK2-mRNA、NEK2蛋白在A549/ DDP細胞系表達水平均顯著高于A549細胞系，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；順鉑、阿霉素對A549/DDP細胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別是（53.08±0.56）、（8.09±0.31）μg/mL，對siRNA-control A549/DDP細胞的IC50分別是（53.09±0.78）、（8.10±0.98）μg/mL，而對siRNA-NEK2 A549/DDP細胞的IC50有顯著下降，其值分別是（18.59±0.10）、（2.30±0.14）μg/mL，兩組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論小分子NEK2干擾RNA沉默NEK2可以提高耐藥的肺癌細胞對化療藥物的敏感性。NEK2可能成為逆轉(zhuǎn)肺癌耐藥的一個新的靶點。

肺癌；細胞耐藥；NEK2；siRNA-NEK2

肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅人類健康，已成為世界上死亡率第一位的惡性腫瘤。約80%的患者就診時已屬晚期，化療成為其主要治療手段，而肺癌耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生是影響化療效果的重要原因。已有研究表明，腫瘤細胞耐藥的分子機制極其復雜，除了進入腫瘤細胞內(nèi)的藥物濃度減少外，DNA斷裂修復加速、靶基因突變、擴增、以及凋亡抑制蛋白的表達差異等均會導致腫瘤細胞耐藥[1]。因此，逆轉(zhuǎn)肺癌耐藥的發(fā)生，已經(jīng)成為肺癌治療研究中的熱點。NEK2（NIMA-related kinase 2，NEK2）是一種哺乳動物細胞中的NIMA相關(guān)激酶，屬于中心體相關(guān)蛋白激酶[2]。NEK2及其同系物過表達可以聚集中心體而過快推進有絲分裂進程甚至直接觸發(fā)染色質(zhì)的分裂[3]。近年來的研究已發(fā)現(xiàn)，NEK2廣泛高表達于多種腫瘤，具有調(diào)節(jié)腫瘤細胞生長的作用[4]；NEK2基因的過表達可顯著增強將化療藥物泵出細胞外的蛋白質(zhì)的活性，導致耐藥性的產(chǎn)生[5]。本研究擬從沉默NEK2基因入手，探討耐藥的肺癌細胞沉默NEK2基因后，化療藥物敏感性的變化，為臨床肺癌化療耐藥逆轉(zhuǎn)，提高化療療效尋找新的靶點和途徑。

1 材料與方法

1.1 材料試劑與細胞系

人肺腺癌敏感細胞系A(chǔ)549細胞和耐順鉑（DDP）人肺腺癌細胞系A(chǔ)549/DDP細胞，均購自第二軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院呼吸病研究所。順鉑、阿霉素（江蘇豪森藥業(yè)有限公司）。CO2細胞培養(yǎng)箱（Binder，德國），激光共聚焦顯微鏡（Bio-Rad，美國），RNAiso plus kit、Prime-ScriptRRT reagent kit、LipofectamineTMRNAiMAX（Invitrogen，美國），ECL化學發(fā)光試劑盒（Boehringer Mannheim，德國），BCA蛋白濃度測定試劑盒（Takara，大連），RPMI-1640培養(yǎng)基、MTT、DMSO、TBST緩沖液、胎牛血清（FCS）（GIBCO BRL，美國）。

1.2 細胞培養(yǎng)

人肺癌A549細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的改良型RPMI-1640培養(yǎng)基中，并置于37℃、5%CO2、達到飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3天以0.25%的胰蛋白酶進行消化傳代。A549/DDP細胞用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液進行復蘇，培養(yǎng)2～3 d后待細胞生長狀態(tài)良好時用半量順鉑培養(yǎng)液（順鉑濃度：0.5 μg/mL）培養(yǎng)1夜，再以全量順鉑培養(yǎng)液（順鉑濃度：1 μg/mL）培養(yǎng)1夜，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，每2～3天傳代1次。

1.3 RNA的提取與RT-PCR

采用RNAiso plus kit試劑盒提取細胞總RNA，按照試劑盒要求操作。NEK2上游引物序列：5'-CCACAGACGAAGTGATGGTG-3'，下游引物序列：5'-TGATTTTCCCAGCGAGTTCT-3'，檢測按實驗室常規(guī)方法進行PCR擴增。定量PCR采用的體系為：dNTPs 2 μL，10×buffer 5 μL，上下游引物各10 pmol，Pfu酶0.5 μL，模板2 μL，加二蒸水至總體積50 μL；擴增條件為：預變性94℃5 min，進入循環(huán)，變性94℃1 min，退火60℃1 min，延伸72℃3 min，30個循環(huán)后，72℃延伸5 min。以β-actin為內(nèi)參，依據(jù)2-ΔΔCT法計算各組細胞mRNA的相對表達量。

1.4 Western blot法

將培養(yǎng)的細胞用0.05%胰蛋白酶消化，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次后離心棄上清，加入含全酶抑制劑和苯甲基磺酰氟（PMSF）的RIPA裂解液冰浴裂解提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。制備10%聚丙烯酰胺凝膠，冰浴進行電泳，電泳分離后用半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后加抗人NEK2多克隆抗體4℃孵育過夜，次日PBS 1次、TBST 2次洗膜后加入辣根酶標記的二抗室溫孵育2 h。洗膜后ECL發(fā)光，X線片顯影、定影、掃描儀掃描膠片。

1.5 NEK2基因siRNA序列的設(shè)計及轉(zhuǎn)染

siRNA片段由上海生工合成。靶向NEK2的siRNA序列為5'-CCAAGGAAAGGCAAUACUUUUdTdT-3'（sense）和5'-AAGUAUUGCCUUUCCUUGGUUdTdT-3'（antisense）。制備終濃度為80 nmol/L的siRNA-脂質(zhì)體復合物，實驗組加入siRNA-NEK2混合物，同時設(shè)置空白對照組。將人耐藥肺腺癌細胞A549/DDP以2×105個/孔接種于6孔板，待細胞生長至70%～80%時，更換無血清培養(yǎng)基，采用LipofetamineTM2000將siRNA-NEK2轉(zhuǎn)染細胞。

1.6 噻唑藍（MTT）法檢測順鉑對沉默NEK2后A549/ DDP細胞增殖活性的影響

取對數(shù)生長期細胞接種于96孔板，實驗分為4組即：A549細胞組（記為A549組）、A549/DDP組、A549/ DDP轉(zhuǎn)染Silencer Negative Control siRNA組（記為siRNA-Control A549/DDP組）及A549/DDP轉(zhuǎn)染siRNA-NEK2組（記為siRNA-NEK2 A549/DDP組）。細胞貼壁后，棄去舊培養(yǎng)基，加入終濃度分別為0.5、1、2、4、8、16、32、64 μg/mL的含藥培養(yǎng)基200 μL，每組濃度設(shè)6個復孔，同時設(shè)不含細胞僅有培養(yǎng)基的空白組和含細胞不加藥物的陰性對照組。加藥完畢放入培養(yǎng)箱孵育24 h。取出培養(yǎng)板，每孔加20 μL MTT，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h。小心吸棄上清，每孔加入150 μLDMSO，震蕩10 min使紫色結(jié)晶充分溶解，酶標儀于490 nm處測定各孔A值，記錄結(jié)果。計算各給藥濃度的抑制率，用SPSS 16.0求各藥物的半數(shù)抑制濃度（IC50）值。細胞增殖抑制率（%）=[1-（A實驗組-A空白組）/（A對照組-A空白組）]×100%。

1.7 統(tǒng)計學方法

所得數(shù)據(jù)用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，計量資料采用t檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 NEK2在A549細胞與A549/DDP細胞系中的表達

采用RT-PCR方法分析比較NEK2-mRNA在A549細胞和A549/DDP細胞系的表達水平，結(jié)果如圖1A顯示，NEK2-mRNA在A549/DDP細胞系中的表達水平明顯高于A549細胞系。證明NEK2-mRNA在人耐藥非小細胞肺癌A549/DDP細胞系中呈現(xiàn)出高表達，提示肺癌耐藥性與NEK2的表達差異性有關(guān)。采用Western blotting方法比較NEK2蛋白在A549細胞及A549/DDP的差異表達。結(jié)果如圖1B所示，NEK2蛋白在A549/DDP中的表達水平明顯高于A549細胞，與基因水平結(jié)果一致，提示NEK2蛋白高表達與肺癌細胞的耐藥有關(guān)。

圖1 NEK2在A549及A549/DDP細胞中的表達水平

2.2 siRNA-NEK2沉默效果鑒定

采用RT-PCR及Western blot檢測siRNA-NEK2轉(zhuǎn)染A549/DDP細胞后的沉默效果。siRNA-NEK2轉(zhuǎn)染A549/DDP細胞24、48 h后，與對照組相比，NEK2 mNRA及蛋白表達水平均下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 siRNA-NEK2轉(zhuǎn)染效果圖

2.3 順鉑及阿霉素對沉默NEK2后A549/DDP細胞增殖活性的影響

采用脂質(zhì)體為轉(zhuǎn)染介質(zhì)，將NEK2小片段RNA導入A549/DDP細胞沉默NEK2基因，并用MTT法檢測順鉑及阿霉素對A549以及沉默NEK2前后A549/ DDP細胞的增殖抑制活性。沉默NEK2基因后，順鉑及阿霉素對siRNA-NEK2 A549/DDP組的增殖抑制活性較A549/DDP組、siRNA-control A549/DDP組明顯增加，IC50明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。說明沉默NEK2可以增加化療藥物對肺癌細胞的敏感性。見圖3、表1。

圖3 順鉑及阿霉素對細胞的增殖抑制曲線

表1 順鉑及阿霉素對細胞半數(shù)抑制濃度影響（μg/mL，x±s）

3 討論

腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性是化療藥物在臨床應用時的常見阻礙，它會導致化療的失敗，與患者治療效果不佳有關(guān)，包括癌癥的復發(fā)和患者的死亡[6]。因此，研究耐藥性的產(chǎn)生機制并尋找應對方法，是提高化療藥物臨床有效性的迫切需要。NEK2屬于絲氨酸-蘇氨酸激酶，集中于染色體著絲，粒通過底物磷酸化調(diào)節(jié)紡錘體的形成和分離，影響細胞有絲分裂從而調(diào)節(jié)細胞的增殖[7]。研究發(fā)現(xiàn)，NEK2基因與增加癌癥抗藥性、加速癌癥生長以及患者死亡率上升存在很強的相關(guān)性。在2500例患者中，NEK2基因表達的增加均與患者的快速死亡有關(guān)[5]。對乳腺癌MDA-MB-231和MDAMB-468細胞耐藥機制的研究中發(fā)現(xiàn)，NEK2干擾siRNA可以改善癌細胞對化療藥物的敏感性[8]。本研究經(jīng)RT-PCR法及Western blot法證明了耐藥的肺癌細胞A549/DDP細胞NEK2-mRNA、NEK2蛋白表達水平顯著高于A549細胞，說明NEK2與肺癌細胞耐藥有關(guān)。

前期研究發(fā)現(xiàn)耐藥的肺癌細胞系A(chǔ)549高表達NEK2，本研究采用siRNA抑制細胞表達NEK2，觀察腫瘤細胞的生長變化。研究通過MTT法發(fā)現(xiàn)抑制NEK2表達后，細胞增殖能力明顯受到抑制，推測與NEK2的微管調(diào)控作用相關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，NEK2與腫瘤細胞中染色質(zhì)不穩(wěn)定性相關(guān)[9]。在細胞有絲分裂過程中，染色質(zhì)的分離是一個依賴于微管活動的復雜過程，微管形成紡錘體后，引起細胞分裂。NEK2在中心體的定位依賴于其C端調(diào)節(jié)區(qū)域內(nèi)的有絲分裂，此定位也是微管結(jié)合所必需的[10]。抑制NEK2能阻礙中心體的成熟和紡錘體相關(guān)蛋白的招募[11]；所以總的來說，NEK2不僅是中心體分裂間期一個關(guān)鍵的組件，而且還是中心體自身裝配及檢修所必需的。研究表明，沉默NEK2后，TNBC細胞對阿霉素的敏感性增加，并且使TNBC細胞凋亡增加，可能是由于有絲分裂的異常[12]。

本研究通過小分子NEK2干擾RNA，并經(jīng)MTT法觀察順鉑、阿霉素對沉默NEK2后A549/DDP細胞增殖抑制活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)順鉑及阿霉素對siRNA-NEK2 A549/DDP細胞的增殖抑制活性與對照組（A549/DDP、siRNA-control A549/DDP）相比明顯增加，IC50明顯下降，細胞凋亡率明顯增加，說明沉默NEK2可以提高耐藥肺癌細胞A549/DDP對相關(guān)化療藥物的敏感性，使得肺癌細胞耐藥得到逆轉(zhuǎn)。本實驗結(jié)果表明，非小細胞肺癌的耐藥性和抗凋亡因子NEK2的表達上調(diào)密切相關(guān)；小分子NEK2干擾RNA沉默NEK2基因能夠提高耐藥肺癌細胞對相關(guān)化療藥物的敏感性，肺癌細胞耐藥得以逆轉(zhuǎn)；NEK2可以成為逆轉(zhuǎn)肺癌細胞耐藥的一個新靶點。

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Study of drug-resistant effect on lung cancer cells with siRNA-NEK2 silencing

CHEN Yongfeng1,2WANG Haijing1LIU Dingyuan1ZHOU Xiangdong11.Department of Respiratory,Southwest Hospital of the Third Military Medical University,Chongqing400038,China; 2.Department of Reception,the 75600 Army Hospital of PLA,Guangdong Province,Shenzhen518048,China

Objective To investigate the drug-resistant effect of siRNA-NEK2 on lung cancer cells lines A549/DDP. Methods Expression of NEK2-mRNA and NEK2-protein was examined in human A549 cells and A549/DDP cells by Real-time PCR and Western blot.The changes of cytotoxic activity were observed on the A549/DDP cells of silence NEK2 by MTT assay.Results The expression of NEK2-mRNA and NEK2 protein were higher in A549/DDP cells than A549 cells(P＜0.05).After treatment with DDP and Epirubicin,the IC50values of A549/DDP cells were(53.08±0.56) and(8.09±0.31)μg/mL respectively,and the IC50values of siRNA-control A549/DDP cells were(53.09±0.78)and (8.10±0.98)μg/mL respectively.While the IC50values were significantly decreased in siRNA-NEK2 A549/DDP cells [(18.59±0.10),(2.30±0.14)μg/mL],two groups were compared,the differences were statistically significant(P＜0.05). Conclusion Silence NEK2 with interfering RNA molecule can reduce the resistance of lung cancer cells with resistant and may increase the sensitivity of chemotherapy-resistant lung cancer patients.Therefore,NEK2 may be a new target that reverses the drug resistance of lung cancer.

Lung cancer;Drug resistance;NEK2;siRNA-NEK2

R563.9

A

1673-7210（2014）02（b）-0017-04

2013-09-06本文編輯：李繼翔）

陳永鋒（1972.6-），男，博士；研究方向：肺癌的耐藥的臨床與基礎(chǔ)。

周向東（1963.10-），男，博士，博士研究生導師，第二軍醫(yī)大學西南醫(yī)院呼吸科主任；研究方向：肺癌及肺癌的耐藥的基礎(chǔ)與臨床。