銀、L-半胱氨酸修飾電極同時測定多巴胺和抗壞血酸

湯優(yōu)霞，孫登明

（淮北師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，安徽淮北235000）

0 引言

多巴胺（DA）是下丘腦和腦垂體中的一種關(guān)鍵神經(jīng)遞質(zhì)，其濃度又受精神因素的影響，腦內(nèi)DA 失調(diào)是引起帕金森氏癥和精神分裂癥的重要原因[1～2]。此外，DA 還具有興奮心臟、增加腎血流量的功能，可用于治療先血性、心源性及感染性休克?？箟难幔ˋA）是廣泛存在于新鮮水果蔬菜及許多生物中的一種重要的維生素，作為一種高活性物質(zhì)，它參與許多新陳代謝過程。在生物體內(nèi)，抗壞血酸是一種抗氧化劑，保護(hù)身體免于自由基的威脅。因此，對DA和AA進(jìn)行測定有著非常重要意義。近年來用修飾電極測定DA 和AA已有許多的報道[3～5]。金屬摻雜聚氨基酸修飾電極也曾用于DA和AA的同時測定[6]，但在測定過程中，修飾在電極表面的金屬會在實驗過程中因電位超過氧化電位而出現(xiàn)氧化脫落的現(xiàn)象，影響電極壽命和測定的重現(xiàn)性。為了更好的提高電極性能，在實驗中采用層層自組裝的方法，將銀和L-半胱氨酸聚合在玻碳電極表面，制備了銀、L-半胱氨酸修飾電極（PLC/Ag/GCE）。并且用該修飾電極研究了DA和AA的電化學(xué)行為，實現(xiàn)了對DA和AA同時測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LK2006A 電化學(xué)工作站(中國，天津市蘭力科化學(xué)電子高技術(shù)有限公司)；pHS-3C 精密酸度計（中國，上?？祪x儀器有限公司）；KQ-250B型超聲波清洗器(中國，昆山超聲波儀器有限公司)。三電極系統(tǒng)：修飾電極或裸的玻碳電極為工作電極，鉑電極為對電極，Ag/AgCl為參比電極。

DA 儲備液：5.00×10-3mol/L；AA 儲備液：5.00×10-2mol/L，避光冷存，使用時再稀釋至實驗所需要的濃度；L-半胱氨酸溶液：5.0×10-3mol/L；硝酸銀（AgNO3）溶液：1.0×10-2mol/L，避光冷存；硝酸 （HNO3）：1.5 mol/L；pH2.0～pH11.0的磷酸鹽緩沖溶液（PBS），實驗用水均為亞沸蒸餾水。

1.2 修飾電極的制備

按文獻(xiàn)[7]對玻碳電極進(jìn)行預(yù)處理，把處理后的電極放入10 mL 含有一定體積的1.0×10-2mol/L AgNO3和1.5 mol/L HNO3的溶液中，靜置10 s，在-0.2～-0.7 V 的電位范圍內(nèi)，掃速160 mV/s 下循環(huán)掃描10 圈。把修飾好的電極（Ag/GCE）取出，清洗干凈后，放入10 mL 含有一定體積的5.0×10-3mol/L L-半胱氨酸的PBS （pH=3.0）聚合溶液中，靜置12s，在-0.4～2.4V 電位范圍內(nèi)，以140 mV/s 掃描速率循環(huán)掃描9 圈，取出用二次亞沸水對電極表面進(jìn)行淋洗，晾干，即可制得PLC/Ag/GCE 修飾電極。

1.3 實驗方法

準(zhǔn)確加入一定量的DA和AA標(biāo)準(zhǔn)溶液于pH=3.0 的PBS溶液，充分搖勻，并轉(zhuǎn)移到電解池中，用三電極系統(tǒng)：PLC/Ag/GCE (工作電極)，鉑電極（輔助電極）和Ag/AgCl（參比電極），靜置10 s，在-0.3 ～0.8 V 的電位范圍內(nèi)，利用循環(huán)伏安法進(jìn)行掃描，記錄圖中峰電位和峰電流。若需進(jìn)行下次實驗，修飾電極要在空白底液中，掃至無峰，再用二次亞沸水沖洗，濾紙吸干后，才可進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 修飾電極的聚合條件

實驗結(jié)果表明，Ag 修飾電極的最佳修飾條件：3.0 mL 1.0×10-2mol/L AgNO3、3.5 mL 1.5 mol/L HNO3、3.5 mL 亞沸水，掃描電位范圍為-0.7 ～-0.2 V，掃描速率為160 mV/s，掃描周次為10 圈，靜置時間為10 s。L-半胱氨酸聚合條件：5.0 mL 5.0×10-3mol/L 的L-半胱氨酸和5.0 mL pH=3.0的PBS 緩沖溶液，掃描電位范圍為-0.4 ～2.4 V，掃描速率為140 mV/s，掃描周次為9 圈，靜置時間為12 s。

2.2 DA和AA在修飾電極上的循環(huán)伏安特性

圖1分別為5.00×10-5mol/L DA(A)；5.00×10-4mol/L AA (B)；5.00×10-5mol/L DA 和5.00×10-4mol/L AA 共存（C）時，在GCE（a）、Ag/GCE（b）、PLC/GCE（c）、PLC/Ag/GCE（d）上的循環(huán)伏安圖。由圖可知，DA 在四個電極上的氧化峰和還原峰的電位基本不變；而AA 由于存在氧化過電位，使得AA 在GCE 上的氧化峰電位高于其他三個修飾電極。DA和AA在Ag/GCE，PLC/GCE、PLC/Ag/GCE 電極上，DA和AA都存在一個明顯的氧化峰，且峰電流逐漸增大。當(dāng)DA和AA共存時，在GCE 上，DA和AA的氧化峰重疊在一起，不能進(jìn)行同時測定，在其他三個修飾電極上DA 和AA都有較好的分離，在PLC/Ag/GCE 電極上，峰電流最大。這說明經(jīng)銀、L-半胱氨酸分層修飾的電極對兩種物質(zhì)的電化學(xué)催化作用明顯增強(qiáng)，測定的選擇性和靈敏度有較大提高，且DA和AA共存時，兩者的氧化峰電位差達(dá)到了0.209 V，不需分離就可進(jìn)行同時測定。

圖1 DA(A)、AA(B)和DA 與AA 共存(C)時在GCE(a)、Ag/GCE(b)、PLC/GCE(c)、PLC/Ag/GCE(d)上的CV 曲線Fig.1 Cyclic voltammetric curves of DA(A)、AA(B)and the mixed solution of DA and AA(C)at GCE(a)Ag/GCE(b),PLC/GCE(c),PLC/Ag/GCE(d).Scan Rate:(A)100 mV/s,(B)120 mV/s,(C)120 mV/s.

2.3 DA和AA在修飾電極上的電化學(xué)行為

2.3.1 底液酸度的影響

在pH為2.0～11.0 范圍內(nèi)，僅改變底液的酸度，分別單獨測定DA 和AA。實驗結(jié)果表明，隨著pH值的增加，DA和AA的峰電位均向負(fù)電位移動。DA 的氧化峰電位與pH 在2.0～11.0 之間呈良好的線性關(guān)系，線性方程為：Epa(V)=0.622 5-0.056 7 pH，r=0.998 2，斜率為56.7 mV/pH；AA 的氧化峰電位與pH 在2.0 ～8.0 之間呈良好的線性關(guān)系，線性方程為：Epa(V)=0.323 0-0.030 0 pH，r=0.990 8，斜率為30 mV/pH。說明DA 在該修飾電極上發(fā)生的為等電子等質(zhì)子的反應(yīng)過程，且AA 的反應(yīng)過程也有質(zhì)子參與。在pH=3.0時，DA 響應(yīng)電流達(dá)最大；而對AA 而言，當(dāng)pH=2.0時，AA 的響應(yīng)電流達(dá)到最大值，考慮到靈敏度和選擇性，pH=3.0 被選作是同時測定DA和AA的最佳酸度。

由于DA和AA發(fā)生電化學(xué)作用的峰電流與得失電子數(shù)有關(guān)，因此根據(jù)文獻(xiàn)[8～9]與實驗結(jié)果，DA和AA在修飾電極上可能的電化學(xué)反應(yīng)分別為：

2.3.2 掃速影響

改變掃描速率，分別對含5.00×10-5mol/L DA 和5.00×10-4mol/L AA 的溶液進(jìn)行實驗測定。實驗結(jié)果表明，在60～600 mV/s 范圍內(nèi)，隨著掃速的不斷增加，DA和AA的氧化峰電流不斷增大，峰電位正移，當(dāng)掃描速率過高時，充電電流較大且峰型變寬，影響測定的精密度和準(zhǔn)確性。在同時測定時DA 和AA時，掃速選擇為120 mV/s。

DA和AA的峰電流的對數(shù)和掃速的對數(shù)成線性關(guān)系，DA 的斜率接近于1.0，它在電極表面的氧化還原過程主要受吸附控制，DA 在修飾電極表面的吸附量可根據(jù)文獻(xiàn)[10]計算。在底液p H=3.0，掃速100 mV/s時，DA 在修飾電極的吸附量為Γ=2.20×10-10mol/cm2。而AA 的斜率接近0.5，它在電極表面的氧化過程主要受擴(kuò)散控制。AA 在電極上的擴(kuò)散性質(zhì)可以用計時電流法研究，圖2(A)為5.00×10-4mol/L AA 在pH=2.0 的PBS 中，分別在四種不同類型的電極上的計時電流曲線，圖2(B)為不同電流強(qiáng)度I 相對于t-1/2的關(guān)系圖。

圖2 AA 在不同電極上的計時電流曲線(A)及電流I 與t-1/2 的關(guān)系圖(B)Fig.2 Chronoamperometry of AA at GCE(a)、Ag/GCE(b)、PLC/GCE(c)and PLC/Ag/GCE(d)(A)and the relationship curve between I and t-1/2(B)

根據(jù)Cottrell 方程，計算不同電極的擴(kuò)散系數(shù)見表1。由計算結(jié)果可見在PLC/Ag/GCE 上，AA 的擴(kuò)散系數(shù)大于在其他三個電極上的擴(kuò)散系數(shù)，這說明AA 在PLC/Ag/GCE 上的電化學(xué)響應(yīng)高于其它三種電極，這與AA 在修飾電極上的循環(huán)伏安法測定的結(jié)果一致。

表1 AA 在不同修飾電極上的擴(kuò)散系數(shù)Tab.1 The diffusion coefficient of AA on different modified glassy carbon electrode

2.4 工作曲線

在最佳測定條件下，用循環(huán)伏安法對DA和AA進(jìn)行分別和同時測定，其線性范圍、線性回歸方程和檢出限結(jié)果見表2。

2.5 精密度和穩(wěn)定性

對5.00×10-5mol/L DA 和5.00×10-4mol/L AA 分別進(jìn)行5次平行實驗，RSD 分別為3.2%和4.1%，表明該電極測定具有良好的重現(xiàn)性。PLC/Ag/GCE 在室溫下放置1 周，相同條件下再次測定時，峰電位和峰電流仍較為穩(wěn)定，表明PLC/Ag/GCE 具有良好的穩(wěn)定性。

2.6 干擾離子

對含有5.00×10-5mol/L DA 和 5.00×10-4mol/L AA 的10 mL 混合溶液進(jìn)行測定，測定允許誤差介于-5%～+5%之間時，測定結(jié)果表明，共存物質(zhì)的允許量(mg)為：Cl-、SO42-、NO3-、K+、Na+、Ca2+、Al3+、Mg2+、Ba2+、L-纈氨酸、L-蘇氨酸、L-酪氨酸、L-天冬氨酸、L-賴氨酸、L-組氨酸(≥1.0 mg，未做最高限)，Cu2+、I-(0.2 mg)，F(xiàn)e2+(0.3 mg)，Pb2+、Cr3+(0.7 mg)。

表2 在PLC/Ag/GCE 上測定DA和AA的分析結(jié)果Tab.2 Analytical parameters for determination of DA and AA at PLC/Ag/GCE

2.7 樣品分析

取多巴胺針劑(10 mg/mL，2 mL/支），稀釋到一定的濃度，取一定的量按照實驗方法進(jìn)行實驗；取維生素C 片研細(xì)后，稱取一定量的樣品，溶解，配制成一定濃度的AA溶液,取一定樣品按實驗方法進(jìn)行測定，結(jié)果如下表3所示：

表3 測定針劑和VC 藥片中的AA 和DATab.3 Determination of DA and AA acid in injection and VC tablet(n=5)

3 結(jié)論

制備了銀、L-半胱氨酸分層修飾電極，并對DA和AA的電化學(xué)行為進(jìn)行研究，證明了該修飾電極會使測定的靈敏度與精密度提高，發(fā)展前景較好。

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