核酸適體－捕獲探針預(yù)雜交修飾制備免標(biāo)記腺苷電化學(xué)傳感器

徐歡,郭小玉,文穎,楊海峰*

（1．上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院化學(xué)系，上海 200234）

（2．上海市位育初級(jí)中學(xué)，上海 200031)

核酸適體－捕獲探針預(yù)雜交修飾制備免標(biāo)記腺苷電化學(xué)傳感器

徐歡1,2,郭小玉1,文穎1,楊海峰1*

（1．上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院化學(xué)系，上海 200234）

（2．上海市位育初級(jí)中學(xué)，上海 200031)

核酸適體（Aptamer）是單鏈寡核苷酸片段，對靶分子具有高親和力和高特異性，具有常規(guī)識(shí)別分子(如抗體和酶)所不具備的一些優(yōu)點(diǎn)，該文基于核酸適體制備了一種用于檢測腺苷的免標(biāo)記電化學(xué)傳感器。將腺苷的核酸適體與帶巰基的捕獲探針通過硫-巰鍵組裝到金電極表面，用6-巰基己醇（MCH）作為缺陷探針封閉電極表面，得到的MCH/Aptamer-Capture/Au界面,構(gòu)筑的電化學(xué)傳感器對腺苷具有特異性識(shí)別功能，檢測腺苷的線性范圍為1×10-6mol/L～2.5×10-4mol/L，檢測限為0.1 μmol/L，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(R.S.D)為2.0%。該傳感器對腺苷的檢測具有靈敏度高、檢測范圍寬、制作簡便、成本低，并且具有良好的選擇性和重現(xiàn)性。

免標(biāo)記；適體；金電極；電化學(xué)傳感器；腺苷

0 引言

核酸適體(也稱核酸適配體或核酸適配子)，是一類由RNA或DNA堿基組成的單鏈寡核苷酸片段，對靶分子具有較高親和力和特異性。它是由一種名為指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化的體外篩選技術(shù)(簡稱SELEX技術(shù))[1～4]，在試管中得到不同分析物的核苷酸片段，方法類似于單克隆抗體。核酸適體與常規(guī)識(shí)別分子(如抗體和酶)相比具備一些優(yōu)點(diǎn)：如可商業(yè)化的體外化學(xué)合成、良好的化學(xué)穩(wěn)定性以及熱變性的可回復(fù)性、結(jié)構(gòu)的可修飾性、易保存等；穩(wěn)定性上比抗體穩(wěn)定、另外核酸適體具有明顯優(yōu)勢和互補(bǔ)性[5]。適體都小于100個(gè)核苷酸,組成比抗體小，因此經(jīng)過組裝可以具有較高的表面密度，所以基于核酸適體的生物傳感器性能更優(yōu),其研究和應(yīng)用具有很廣闊的前景，目前大量的研究者投入到核酸適體的研究[6～12]。

核酸適體電化學(xué)傳感器是用核酸適體作為分子識(shí)別原件，通過不同方法固定到信號(hào)轉(zhuǎn)換器上，通過電子導(dǎo)線連接成裝置，再結(jié)合電化學(xué)的方法，用于待測物質(zhì)的定性和定量檢測。Rodriguez等[13]運(yùn)用電化學(xué)交流阻抗技術(shù)制備了用于識(shí)別溶菌酶的免標(biāo)記核酸適體傳感器，在沒有加入溶菌酶時(shí)，由于核酸適體鏈帶負(fù)電，對[Fe(CN)6]4－/3－形成了天然的電子屏障，阻抗變大；當(dāng)適體與帶正電荷的溶菌酶特異性結(jié)合后，就吸引了[Fe(CN)6]4－/3－，發(fā)生了電子傳遞導(dǎo)致阻抗變小，通過阻抗的變化來達(dá)到對蛋白質(zhì)的檢測；Du等[14]利用兩段核酸適體通過結(jié)合凝血酶增大系統(tǒng)阻抗來放大信號(hào)，再結(jié)合三磷酸腺苷使阻抗減小，通過阻抗的變化實(shí)現(xiàn)一支傳感器同時(shí)可檢測兩種物質(zhì)。

腺苷(Adenosine)是能量化合物三磷酸腺苷(ATP)的中心，是核苷的一種，由β－N9－配糖鍵連結(jié)呋喃核糖和腺嘌呤的其中一部分。腺苷在生物化學(xué)上是非常重要的，是以三磷酸腺苷(ATP)或者雙磷酸腺苷(ADP)的形式轉(zhuǎn)移能量的，又或是以環(huán)狀單磷酸腺苷(cAMP)進(jìn)行信號(hào)傳遞等。在人類的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，腺苷在種種生理及病理過程中也扮演著性能良好的調(diào)節(jié)器作用[15]。因此，檢測腺苷的方法引起了越來越多的關(guān)注[16～18]。

在該工作中，設(shè)計(jì)了一種免標(biāo)記的核酸適體電化學(xué)傳感器用于檢測腺苷，采用電化學(xué)交流阻抗方法，對核酸適體傳感器檢測目標(biāo)物腺苷前后的電化學(xué)阻抗變化實(shí)現(xiàn)對腺苷的定量檢測。首先在處理潔凈的金電極上組裝核酸適體和捕獲探針的混合液，而后用6－巰基己醇（MCH）作為缺陷探針封閉電極表面，制備得MCH/Aptamer－Capture/Au結(jié)構(gòu)的核酸適體傳感器，用于腺苷的檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

核酸適體序列：3'－ATG TCT GGA AGG AGG CGT TAT GAG GGG GTC CA－5'(0．2 μmol/L，由PBS溶液配制成)(上海生工)；捕獲探針序列：5'－SH－(CH2)6－TAC AGA CCT TCC－3'(0．2 μmol/L，由PBS溶液配制成)(上海生工)；6－巰基己醇(MCH, 1 mmol/L)(sigma公司)；腺苷(Adenosine)、鳥苷(Guanosine)、尿苷(Uridine)、胞啶(Cytidine)(國藥集團(tuán))；10 mmol/L的PBS緩沖溶液(pH=7．4)：由KH2PO4和Na2HPO4調(diào)配而成；實(shí)驗(yàn)試劑等級(jí)均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為二次超純水(＞18MΩ·cm)，且需經(jīng)過滅菌器高壓滅菌。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

Veeco Nano III a Multimode原子力顯微鏡(AFM)，表征使用平板印刷金膜電極為基底(禪譜科技股份有限公司)；電化學(xué)工作站(CHI 660d型；上海辰華有限公司)；立式壓力蒸汽滅菌器(YXQ－LS－30SII；上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 適體與探針雜交溶液的配制

將濃度為0．2 μmol/L的核酸適體和探針序列以體積比1．5∶1相互混合16 h，使其完全雜交成雙螺旋結(jié)構(gòu)，簡稱：適體－探針(Aptamer－Capture)混合液，通過巰基將核酸適體組裝到金電極表面。

1.3.2 核酸適體傳感器的制備

金電極(d=2 mm)首先用金相砂紙(6號(hào))打磨平滑以除去界面上殘留的實(shí)驗(yàn)雜質(zhì)，接著依次用0．3 μm和0．05 μm的α－三氧化二鋁粉輕輕畫圈打磨，拋光成鏡面，并分別用二次超純水、乙醇、二次超純水對金電極進(jìn)行超聲洗凈，緊接著將金電極用氮?dú)獯蹈捎?．5 mol/L的硫酸溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描至出現(xiàn)金電極的特征峰，掃描范圍為－0．2～1．5 V。最后用二次超純水快速?zèng)_洗電極吹干備用。

取3 μL適體－探針混合液滴涂于處理干凈的金電極界面上，自組裝2 h，然后用二次超純水快速浸洗1 min以除去未組裝的混合液，并用氮?dú)獯蹈桑唤又偃? μL，1 mol/L的MCH滴涂于電極表面，自組裝2 h,用于封閉電極，即制得用于檢測腺苷的核酸適體電化學(xué)傳感器，記作MCH/Aptamer-Capture/Au electrode。

用滅菌水配制不同濃度的腺苷溶液、鳥苷溶液、尿苷溶液和胞啶溶液，分別取5 μL滴涂于制備好的核酸適體電化學(xué)傳感器上，在室溫下雜交90 min，即目標(biāo)物的檢測過程。

圖1為電極的制備過程和腺苷的檢測過程示意圖。

圖1 傳感器組裝過程及檢測示意圖Fig.1Schematic diagram for preparation of the sensing system and the detection of adenosine

1.3.3 測試方法

采用電化學(xué)交流阻抗技術(shù)來檢測腺苷，并結(jié)合循環(huán)伏安法測試核酸適體傳感器。實(shí)驗(yàn)在室溫條件下，于含10 mmol/L[Fe(CN)6]4-/3-和1 mol/L KCl的PBS緩沖溶液(pH=7.4)中進(jìn)行；電化學(xué)交流阻抗的測定的頻率范圍設(shè)置為0.01～105Hz，所加的交流電位幅值為5 mV，循環(huán)伏安曲線設(shè)置在0.5～-0.2 V范圍內(nèi)掃描。電化學(xué)實(shí)驗(yàn)采用傳統(tǒng)的三電極系統(tǒng)：修飾電極為工作電極，鉑電極和Ag/AgCl電極分別作為對電極和參比電極。

2 結(jié)果與討論

2.1 循環(huán)伏安法表征

圖2是不同修飾電極的循環(huán)伏安曲線。從圖中可見：裸金電極(a)在溶液中呈現(xiàn)出一對峰形良好的準(zhǔn)可逆氧化還原峰，在修飾了適體-探針混合液之后，電極上的峰電流稍有降低，即曲線b；再當(dāng)組裝了6-巰基己醇后(曲線c)，峰電流下降較大，說明MCH起到了電極表面的封閉作用；曲線d是核酸適體傳感器與0.1 mmol/L腺苷溶液雜交之后的循環(huán)伏安曲線，曲線中可見峰電流較曲線c又稍有增大，說明電極表面的腺苷適體可能被拽離電極表面使表面有孔洞出現(xiàn)而促進(jìn)了體系內(nèi)的電子傳遞過程。

圖2 (a)裸金電極；(b)Aptamer-Capture Probe/Au electrode；(c)MCH/Aptamer-Capture Probe/Au electrode；(d)MCH/Aptamer-Capture Probe/Au electrode與0.1 mmol/L腺苷雜交后在5 mmol/L[Fe(CN)6]4-/3-(含有0.1 mol/L KCl)的PBS（100 mmol/L,pH=7.4）溶液中的循環(huán)伏安曲線Fig.2(a)bare Au electrode;(b)Aptamer-Capture Probe/Au electrode;(c)MCH/Aptamer-Capture Probe/Au electrode;(d) MCH/Aptamer-Capture Probe/Au electrode treated with 0.1 mmol/L adenosine in PBS（100 mmol/L,pH=7.4）containing 5 mmol/L[Fe(CN)6]4-/3-and 0.1 mol/L KCl

2.2 電化學(xué)交流阻抗表征

圖3 不同修飾電極的Nyquist曲線;(a)裸金電極；(b) Aptamer-Capture Probe/Au修飾電極；（c）MCH/ Aptamer-Capture Probe/Au修飾電極與0.1 mmol/L腺苷作用后；（d）MCH/Aptamer-Capture Probe/Au修飾電極；（e）MCH/Aptamer-Capture Probe/Au修飾電極在PBS溶液中浸泡90 min后；(f)MCH/Aptamer-Capture Probe/Au修飾電極與1 μmol/L腺苷作用后Fig.3Nyquist plots of impedance spectra obtained at(a) bare Au electrode;(b)Aptamer-Capture Probe/Au electrode;(c)MCH/Aptamer-Capture Probe/Au electrode; treated with 0.1 mmol/L adenosine(d)MCH/Aptamer-Capture Probe/Au electrode;(e)MCH/Aptamer-Capture Probe/Au electrode treated in PBS for 90 min;(f)MCH/ Aptamer-Capture Probe/Au electrode treated with 1 μmol/L adenosine

交流阻抗圖進(jìn)一步表征了組裝和檢測過程。從圖3中，曲線a是裸金電極在10 mmol/L [Fe(CN)6]4-/3-，含1mol/LKCl的PBS緩沖溶液（pH= 7.4）中的電化學(xué)交流阻抗曲線，從中可見其為線狀，說明在體系中電子傳遞情況良好。當(dāng)組裝上適體-探針混合液后，即曲線b，交流阻抗曲線出現(xiàn)一個(gè)小的半圓，說明在體系中電子傳遞過程受到了阻礙，進(jìn)而也說明適體-探針序列成功的組裝到了電極表面；當(dāng)電極再組裝上MCH后，曲線d,圖中可見交流阻抗曲線的半圓急劇變大，說明體系中電子傳遞被進(jìn)一步阻礙，也說明MCH成功的封閉了電極界面上的吸附位點(diǎn)；曲線c和曲線f是制備的核酸適體傳感器分別檢測了0.1 mmol/L和1 μmol/L的腺苷溶液后的交流阻抗曲線，從圖中可得交流阻抗隨著目標(biāo)分子濃度增大，阻抗呈先變大后變小的趨勢，當(dāng)目標(biāo)分子濃度再大時(shí)，阻抗又呈現(xiàn)變大的趨勢；并且為了說明交流阻抗的變化是由于核酸適體傳感器對腺苷的特異性結(jié)合能力，在相同情況下在不含腺苷的PBS溶液放置90 min后用電化學(xué)交流阻抗技術(shù)檢測阻抗變化即曲線e，發(fā)現(xiàn)阻抗不變，從而證明了核酸適體是由于和腺苷的特異性結(jié)合使得檢測前后發(fā)生了阻抗變化。鑒于這樣的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，對核酸適體傳感器檢測腺苷的過程的機(jī)理進(jìn)行了推測：

①目標(biāo)物低濃度時(shí)，腺苷僅與適體中的一段發(fā)生了雜交，未能使適體完全離開電極表面，并且由于適體比較長，在雜交過程中可能會(huì)出現(xiàn)交纏現(xiàn)象，EIS呈現(xiàn)變大；

②目標(biāo)物濃度稍大時(shí)，電極表面的適體與腺苷幾乎完全雜交而使適體離開電極表面，EIS表現(xiàn)為變?。?/p>

③當(dāng)目標(biāo)物濃度過大時(shí)，由于電極表面適體已被完全雜交拽離電極表面，但由于雜交過程中電極表面過分擁擠，使電極上遺留的物質(zhì)發(fā)生了交纏或倒塌，EIS又呈現(xiàn)變大[19～20]。

2.3 原子力顯微鏡（AFM）表征

圖4是核酸適體傳感器層層構(gòu)筑在平板印刷金膜電極上的原子力顯微鏡表征圖。圖4a為裸金膜電極，可見表面非常的光滑，說明了平板印刷金膜電極表面非常均勻；圖4b為組裝了適體-探針混合液和MCH后的核酸適體傳感器，其表面可見略帶有孔洞狀的膜，組裝的物質(zhì)在表面較均勻；圖4c是核酸適體傳感器與1 μmol/L腺苷溶液雜交90 min后，圖中可見有似小顆粒狀的腺苷分子黏在電子表面；圖4d是核酸適體傳感器與0.1 mmol/L腺苷溶液雜交90 min后，可得修飾電極表面又顯得稍光滑了一些，圖4e是核酸適體傳感器與1 mmol/L的腺苷溶液雜交90 min后，圖中表面可見好似粘了厚厚的一層膜。

為了進(jìn)一步探討核酸適體傳感器檢測腺苷的過程的機(jī)理，分別從原子力顯微鏡的三維圖中測量了上述核酸適體傳感器的層層組裝后的表面粗糙度，如圖5，得出結(jié)果為：5a裸金膜電極的表面粗糙度為3.914 nm，5b當(dāng)組裝了適體-探針混合液和MCH后的核酸適體傳感器的表面粗糙度為37.136 nm，5c核酸適體傳感器與1 μmol/L腺苷溶液雜交后的表面粗糙度為38.007 nm，5 d核酸適體傳感器與0.1 mmol/L腺苷溶液雜交后的表面粗糙度為13.437 nm，5e核酸適體傳感器與1 mmol/L的腺苷溶液雜交后，表面粗糙度為16.640 nm。從而也從另一角度證實(shí)了上面提出的核酸適體傳感器檢測腺苷的過程的機(jī)理。

圖4 (a)裸金片，(b)核酸適體傳感器，(c)與1 μmol/L腺苷反應(yīng)后，(d)與0.1 mmol/L腺苷反應(yīng)后，(e)與1 mmol/L腺苷反應(yīng)后的金片的原子力顯微鏡平面表征圖Fig.4AFM images of(a)bare Au;(b)Modified electrode;(c)After reacting with 1 μmol/L adenosine;(d)After reacting with 0.1 mmol/L adenosine;(e)After reacting with 1 mmol/L adenosine

圖5 (a)裸金片;(b)核酸適體傳感器;(c)核酸適體傳感器與1 μmol/L腺苷反應(yīng)后;(d)核酸適體傳感器與0.1 mmol/L腺苷反應(yīng)后;(e)與1 mmol/L腺苷反應(yīng)后的金片的原子力顯微鏡三維表征圖Fig.5AFM 3D images of(b)Modified electrode;(c)After reacting with 1 μmol/L adenosine;(d)After reacting with 0.1 mmol/L adenosine;(e)After reacting with 1 mmol/L adenosine

2.4 核酸適體傳感器對腺苷的檢測

圖6 核酸適體傳感器與腺苷雜交前后的交流阻抗變化值ΔRet與腺苷濃度對數(shù)的線性關(guān)系Fig.6The plot of ΔRetvs logarithm of the concentration of adenosine

將制備好的核酸適體傳感器對不同濃度的腺苷溶液進(jìn)行雜交90 min，對傳感器在雜交前后的阻抗變化ΔRet作為檢測信號(hào)，來對腺苷做定量測定。并且每個(gè)數(shù)據(jù)為三次平行測定的ΔRet的平均值，利用ΔRet與腺苷溶度的對數(shù)作圖，即圖6，在腺苷濃度范圍為1×10-6mol/L～2.5×10-4mol/L內(nèi)，ΔRet與腺苷濃度的對數(shù)成很好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)R為0.997，最低檢測限為0.1 μmol/L。

2.5 核酸適體傳感器的選擇性

為了證明核酸適體傳感器與腺苷是特異性的結(jié)合，用了其他三個(gè)物質(zhì)分別為尿苷、胞啶和鳥苷，濃度均為1 mmol/L，在相同條件下與制備的核酸適體傳感器進(jìn)行了雜交檢測，如圖7。得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，尿苷和胞啶與核酸適體雜交前后的ΔRet幾乎沒有變化；當(dāng)與1 mmol/L鳥苷雜交前后ΔRet有些許增大，可能是鳥苷與腺苷的結(jié)構(gòu)較為相似造成了一定的干擾[21]；但當(dāng)核酸適體傳感器與1 μmol/L腺苷雜交時(shí)ΔRet的變化遠(yuǎn)大于1 mmol/L鳥苷雜交后的ΔRet值，說明制備的核酸適體傳感器對腺苷的檢測具有較好的選擇性。

圖7 核酸適體傳感器分別與1 mmol/L的(a)尿苷(b)胞啶(c)鳥苷和(d)1 μmol/L的腺苷進(jìn)行作用前（實(shí)線）后（虛線）檢測得到的EIS圖Fig.7EIS recorded before(solid line)after(dotted line)adding 1 mmol/L(a)Uridine(b)Cytidine(c)Guanosine and(d)1 μmol/L adenosine

2.6 核酸適體傳感器的重現(xiàn)性

用5支相同條件下制備的核酸適體傳感器對0.1 mmol/L的腺苷溶液雜交前后變化的交流阻抗值ΔRet進(jìn)行了比較，得其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（R. S.D.）為2.0%，說明了制備的核酸適體傳感器具有良好的重現(xiàn)性。

3 結(jié)論

該文中制備了一種新型的免標(biāo)記核酸適體傳感器，采用電化學(xué)交流阻抗技術(shù)定量檢測腺苷，通過實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象對雜交過程中的作用機(jī)理做了推測。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果表明該傳感器對腺苷的檢測具有靈敏度高、檢測范圍寬、制作簡便、成本低，并且具有良好的選擇性和重現(xiàn)性。

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Aptamer－capture－prehybridization－modification for label-free adenosine electrochemical sensor

Xu Huan1,2,Guo Xiao-yu1,Wen Ying1,Yang Hai-feng1*
(1.Department of Chemistry,College of life and Environment Sciences,Shanghai Normal University, Shanghai 200234,China)
（2.Shanghai Wei Yu Middle School，Shanghai 200031，China）

Compared with conventional recognition molecules(such as antibodies and enzyme),aptamer as an oligonucleotide clip has hiwgh affinity and high specificity of target molecules..Herein,we prepared a label-free aptamer electrochemical biosensor for the detection of adenosine.Firstly,the cleaned gold electrode covalently bonded the aptamer-capture system and then the Aptamer-Capture/Au electrode was immersed into 2-Mercaptoethanol（MCH）solution to prepare the MCH/Aptamer-Capture/Au-based electrochemical sensor.It can specifically identify the adenosine for the detection linear range from 1×10-6to 2.5×10-4mol/L with the detection limit of 0.1 μmol/L. On the same condition,the detection of the same concentration of adenosine,the relative standard deviation(R.S.D) was about 2.0%.The resultant adenosine sensor has high sensitivity,wide detection range,easy-made process,low cost as well as good selectivity and reproducibility.

label-free;aptamer;Au electrode;electrochemical sensor;adenosine

國家自然科學(xué)面上基金項(xiàng)目（21475088）

*通訊聯(lián)系人，E-mail:haifengyang@yahoo.com;Tel.:Fax:021 64322511(楊海峰).