基于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)放大信號的適體傳感器的研究

彭德敏,袁若

（西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400715）

基于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)放大信號的適體傳感器的研究

彭德敏,袁若*

（西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400715）

該文基于多孔納米鈀復(fù)合物（pPdNPs）和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HCR）對信號的放大，成功制備出一個高靈敏、無標(biāo)記的夾心式新型電化學(xué)適體傳感器用于凝血酶（TB）的檢測。首先，沉積的納米金有很好的生物相容性和大的比表面積，用于固載更多的凝血酶適體鏈（TBAI）；同時，利用多孔納米鈀大的表面積來固載更多的TBAII和單鏈DNA（S1）;電極上的TBAI捕獲溶液中的TB后，與多孔納米鈀復(fù)合物（pPdNs-TBAⅡ-S1）組裝;再與S1、單鏈DNA（S2）和電活性物質(zhì)亞甲基藍(lán)（MB）的混合物通過雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，形成內(nèi)嵌有大量MB的雙鏈DNA（dsDNA），以達(dá)到信號放大的效果。經(jīng)實驗研究表明，該傳感器構(gòu)建方法簡單，切實可行，大大提高了電化學(xué)適體傳感器的靈敏度。

電化學(xué)適體傳感器；凝血酶；納米粒子；雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；多孔納米鈀

0 引言

適體也稱為核酸適體、適配體、適配子等?？梢允荝NA，單鏈DNA或者雙鏈DNA[1～3]，長度一般為25～80個核苷酸[4～6]。適體與靶分子的結(jié)合和抗原—抗體作用相似，適體具有明顯優(yōu)于抗體的許多特性。具有靶分子范圍廣、與配體作用親和高度穩(wěn)定性、高特異性強、制備方法簡單、安全經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點。目前，適體技術(shù)開始廣泛應(yīng)用于分子識別、實驗診斷、疾病治療、藥物研究及生物傳感器等方面。

由于可以實現(xiàn)對材料的修飾和優(yōu)化以滿足各種應(yīng)用需求，近日納米復(fù)合材料已經(jīng)成為一個新的研究熱點，并被廣泛應(yīng)用于生物傳感器的構(gòu)建。納米材料不僅被廣泛用于增加電極的比表面積和促進(jìn)電極界面間的電子轉(zhuǎn)移[7～8]，還用來固載大量的生物分子或其他物質(zhì)，從而放大電化學(xué)信號和增強生物傳感器的性能。多孔納米鈀作為一種新型的納米材料，具有大的比表面積、優(yōu)異的導(dǎo)電性和良好的生物相容性[9]，可以鏈接更多的TBA和單鏈DNA1（S1），以至于和S1、S2形成雙鏈螺旋DNA結(jié)構(gòu)可固載更多的電活性物質(zhì)亞甲基藍(lán)（MB）。因此，用多空納米鈀來構(gòu)建生物傳感器，不僅可以通過一個簡單的固定過程增加電極表面電活性物質(zhì)的固載量，同時還可以充當(dāng)一個電子轉(zhuǎn)移通道，有效地加速電極和檢測分子之間的電子轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致更快速和靈敏的電流響應(yīng)。

雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（hybridization chain reaction，HCR）是一個無酶參與的反應(yīng)過程，通過設(shè)計合理的不同寡核苷酸，由一小段核苷酸鏈作為引發(fā)劑誘導(dǎo)寡核苷酸相互雜交形成一條具有二維或三維空間結(jié)構(gòu)的dsDNA[10]。由于它是引發(fā)劑引起的反應(yīng)，可以有效減少假陽信號，降低背景電流。并且，每一引發(fā)劑可以觸發(fā)一個HCR反應(yīng)形成長鏈dsDNA,使許多寡核苷酸連接在一起，可使傳感器的信號放大。Chen等[11]利用雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)信號放大技術(shù)構(gòu)建了超靈敏電致化學(xué)發(fā)光傳感器。通過雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)得到的長鏈dsDNA能將大量的發(fā)光物質(zhì)嵌入其中，大大提高了傳感器靈敏度。Chen等[12]同樣也利用雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)形成dsDNA結(jié)合電活性物質(zhì)氨基釕構(gòu)建了簡單、靈敏的免標(biāo)記型電化學(xué)傳感器。由于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)不需要酶的加入，以核苷酸鏈作為引發(fā)劑誘導(dǎo)鏈聚合，反應(yīng)條件溫和，操作簡單，可適用于其他傳感器的信號放大。

因此，該文基于多孔納米鈀復(fù)合物（pPdNPs）和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)雙重放大構(gòu)建了非標(biāo)記型電化學(xué)適體傳感器。金納米粒子首先固定在玻碳電極表面，用于固載凝血酶適體鏈（TBAI）和結(jié)合目標(biāo)物凝血酶（TB）；同時，利用多孔鈀納米粒子大的表面積來固載更多的TBAII和單鏈DNA（S1），用于放大響應(yīng)電流；當(dāng)電極上的TBAI捕獲溶液中的TB后，與多孔納米鈀復(fù)合物（pPdNs-TBAⅡ-S1）組裝;再與S1、單鏈DNA（S2）和電活性物質(zhì)亞甲基藍(lán)（MB）的混合物通過雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，形成內(nèi)嵌有大量MB的雙鏈DNA（dsDNA），使所得的響應(yīng)信號進(jìn)一步增加，從而有效地提高了電極靈敏度。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI660D電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司），pHS-4C型酸度計（成都方舟科技開發(fā)公司），BRANSONIC 200超聲清洗儀（德國BRANSON ULTRASCHALL公司），AB204-S電子天平（瑞士Metter Toledo公司）。實驗采用三電極體系，修飾過的金電極（GCE，φ=4mm）為工作電極，鉑電極為輔助電極，飽和甘汞電極（SCE）為參比電極。

凝血酶（TB），氯金酸（HAuCl4），L-半胱氨酸、血紅蛋白（BHB）、赭曲霉毒素A（OTA）、牛血清白蛋白（BSA）、亞甲基藍(lán)（MB）和巰基己烷（96%，HT）購于Sigma公司（美國），含有0.1 mol/L KCl和5.0 mmol/L Fe(CN)64-/3-的0.1 mol/L PBS緩沖溶液（pH=7.0）為循環(huán)伏安測試底液。

巰基標(biāo)記的凝血酶適體鏈（TBA）：5'-SH-(CH2)6-GGTTGGTGTGGTTGG-3'

單鏈DNA（S1）：5'-NH2-ATAGCAATTAAGCCAGCCAGGTTCGGTGCAT-NH2-3'

單鏈DNA（S2）：5'-NH2-GCTGGCTTAATTGCTATATGCACCGAACCTG-NH2-3'

均購于上海生工生物。實驗室用水均為二次去離子水。

1.2 多孔納米鈀粒子的制備

多孔納米鈀粒子依據(jù)如下步驟制備：首先，取0.4 mL濃度為10 mmol/L的氯鈀酸鉀溶液，18 mg的氯代十六烷基吡啶和5 mL蒸餾水于燒杯中并將上述混合溶液攪拌均勻。其次，在攪拌的條件下將0.3 mL的新制備的抗壞血酸（0.1 mol/L）溶液快速滴加到上述溶液中。然后將所得溶液轉(zhuǎn)移至20 mL反應(yīng)釜中在35℃條件下加熱3 h。最后將所得到的溶液離心，洗滌兩次。

1.3 電化學(xué)傳感器的制備

將玻碳電極[11]（GCE，Φ=4 mm）在麂皮上分別用0.3和0.05 μm的Al2O3粉打磨拋光成鏡面，用乙醇和蒸餾水超聲清洗，清洗后的電極置于常溫下晾干，然后，將電極在-0.2 V恒電位下置于2 mL HAuCl4（1%）溶液中沉積30 s，形成一層致密納米金層，用于固載巰基標(biāo)記的凝血酶適體鏈TBA。用去離子水清洗電極后滴加20 μL TBA溶液（2.5 μmol/L）在電極表面并孵育14～16 h。孵育完成后，為了封閉電極表面的非特異性結(jié)合位點，用10 μL HT（1.0 mmol/L）溶液滴至電極表面孵育40 min，電極洗凈，將適體傳感器置于4℃的冰箱中保存待用。圖1為電化學(xué)適體傳感器逐步修飾過程的示意圖。

圖1 電化學(xué)適體傳感器逐步修飾過程示意圖Fig.1The schematic illustration of the aptasensor fabrication process

1.4 測試方法及檢測原理

該實驗采用的是三電極體系:裸玻碳電極及修飾電極為工作電極，鉑絲電極為對電極，飽和甘汞電極（SCE）為參比電極。在含有0.1 mol/L KCl和5.0 mmol/L Fe(CN)64-/3-的0.1 mol/L PBS（pH=7.0）緩沖溶液中進(jìn)行，采用循環(huán)伏安法[12]（CV）和差分脈沖伏安法[13]（DPV）對電極的響應(yīng)性能進(jìn)行測試，循環(huán)伏安法一般掃描電位為-0.45～0.05 V（vs.SCE），電位掃描速度為50 mV/s。差分脈沖伏安法掃描電位為-0.7～0.1 V（vs.SCE），脈沖寬度為0.06，振幅為0.05 V，采樣寬度為0.02。

適體傳感器電流響應(yīng)信號通過夾心反應(yīng)模式得到，在對目標(biāo)物凝血酶定量分析時，傳感器表面凝血酶適體鏈與樣品溶液中的凝血酶分子特異性結(jié)合后，凝血酶分子再與pPdNPs-TBAⅡ-S1復(fù)合物結(jié)合，在S1和S2的存在下發(fā)生雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)形成。通過靜電吸附的作用電活性物質(zhì)亞甲基藍(lán)固載在雙鏈dsDNA上，使修飾電極在發(fā)生特異識別前后的差分脈沖電流值發(fā)生變化。隨著特異識別反應(yīng)程度的加深，測得的響應(yīng)電流值隨凝血酶濃度的增加而增強，并與凝血酶樣品的濃度對數(shù)成正比例關(guān)系。

2 結(jié)果與討論

2.1 電極組裝過程的循環(huán)伏安表征

循環(huán)伏安法已被證實是一種非常有力的界面研究工具，該實驗利用它來研究所制備的適體傳感器的電化學(xué)特性。圖2是電極層層組裝過程在含有0.1 mol/L KCl和5.0 mmol/L Fe(CN)64-/3-的0.1 mol/L PBS（pH=7.0）緩沖溶液中的循環(huán)伏安表征圖譜。曲線a是玻碳電極的循環(huán)伏安圖譜，有一對良好的Fe(CN)33-/4-氧化還原峰。b是當(dāng)將納米金修飾在電極表面后測得的曲線，循環(huán)伏安氧化還原峰電流明顯增強，這是因為nano-Au具有優(yōu)良的導(dǎo)電性。當(dāng)電極表面修飾上TBAⅠ后，由于TBAⅠ具有一定的電惰性，循環(huán)伏安氧化還原峰電流明顯降低（曲線c）。接著，在用HT封閉修飾電極表面的非特異性吸附位點之后，由于HT具有封閉性能，所以循環(huán)伏安氧化還原峰電流進(jìn)一步降低（曲線d）。e是制備好的電極與20 nmol/L目標(biāo)物TB溶液孵育40 min后測得的曲線，由于電惰性的TB結(jié)合在了電極表面，循環(huán)伏安氧化還原峰電流持續(xù)降低。

圖2 電極在自組裝過程中的循環(huán)伏安圖譜Fig.2Cyclic voltammograms of different modified electrodes in 0.1mol/L PBS with 0.1 mol/L KCl and 5.0 mmol/L Fe(CN)64-/3-(pH7.0):(a)glassy carbon electrode;(b) nano-Au films modified electrode;(c)combined with TBA; (d)blocked with HT;(e)combined with thrombin (20 nmol/L).All potentials are given vs.SCE and the scan rate was 50 mV/s

2.2 時間的優(yōu)化

TBA-TB特異識別的時間對適體傳感器響應(yīng)性能有著重大的影響。圖3是傳感器在不同時間測試得到的電流響應(yīng)值。當(dāng)適體傳感器與20 nmol/L的TB標(biāo)準(zhǔn)血清樣品依次孵育10,20,30, 40,50 min，然后再將傳感器置于含F(xiàn)e(CN)33-/4-的緩沖溶液中進(jìn)行CV檢測。該文課題組發(fā)現(xiàn)，在40 min以前TBA-TB特異識別的電流響應(yīng)值不斷減小，然而40 min之后基本保持不變，說明TBA-TB特異識別已經(jīng)達(dá)到飽和。所以，在該實驗過程中40 min作為適體傳感器的孵育時間。

2.3 不同修飾電極的電化學(xué)對比

圖3 適體傳感器孵育時間的影響Fig.3Influence of the incubation time on current response of the aptasensor

為了考察多孔鈀納米粒子和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對傳感器電流響應(yīng)的增強作用。分別用差分脈沖伏安法考察了不同傳感器的電流值：(a)只孵育TB（10 nmol/L）的傳感器，(b)修飾有的pPdNPs-TBAⅡ-S1復(fù)合物傳感器，(c)修飾有的pPdNPs-TBAⅡ-S1復(fù)合物進(jìn)行HCR放大的傳感器。由圖4可以看出，修飾有pPdNPs-TBAⅡ-S1復(fù)合物并進(jìn)行的HCR放大的傳感器在0.1 mol/L PBS（pH= 7.0）緩沖溶液為測試底液得到的電流變化值最大，且靈敏度明顯增強。由此可以看出，HCR放大技術(shù)對傳感器的響應(yīng)電流有重大影響，可使傳感器的靈敏性增強，各濃度之間的差別更加明顯。

2.4 響應(yīng)曲線

圖4 不同傳感器的差分脈沖圖譜Fig.4The DPVs of various electrodes.(a)in the absence of TB;(b)in the present of TB(10 nmol/L)with pPdNPs-TBAⅡ-S1and(c)with pPdNPs-TBAⅡ-S1HCR amplification

圖5 （A）孵育不同濃度凝血酶后的還原峰，（B）傳感器在PBS緩沖溶液中測試所得的還原峰電流與凝血酶濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5(A)Incubated with different concentrations of TB after reduction peaks,(B)Aptaensors in PBS buffer solution (pH=7.0)to test the reduction peak current and the concentration of TB standard curve

在對目標(biāo)物進(jìn)行定量分析時，在適體傳感器上孵育不同濃度的TB并進(jìn)行后續(xù)步驟后在0.1 mol/L PBS（pH=7）中用差分脈沖伏安法進(jìn)行檢測。傳感器上的凝血酶適體鏈捕獲溶液中的凝血酶后與pPdNPs-TBAⅡ-S1復(fù)合物反應(yīng)，并通過雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)形成含有大量電活性物質(zhì)MB的雙鏈dsDNA，從而得到電化學(xué)信號（圖5 A）。從實驗可得，該電化學(xué)傳感器在所測凝血酶濃度范圍內(nèi)（0.001～20 nmol/L）呈現(xiàn)良好線性關(guān)系（圖5 B）。線性方程是I=-15.63-3.034 lgc,相關(guān)系數(shù)r= 0.995 2，檢測下限為0.000 3 nmol/L。

2.5 電化學(xué)適體傳感器選擇性分析

電化學(xué)適體傳感器的選擇性通過對傳感器孵育不同干擾物質(zhì)來做對照試驗。在電化學(xué)傳感器孵育如BSA(100 nmol/L)、Hb(100 nmol/L)、L-半胱氨酸(100 nmol/L)、OTA(100 nmol/L)等不同干擾物質(zhì)，傳感器測得的還原峰電流沒有明顯的變化。然而，將含有凝血酶的五種混合液（mix）孵育在電化學(xué)適體傳感器上時，其測得的還原峰電流與只孵育凝血酶所得的還原峰電流沒有明顯的變化。綜上所述，該電化學(xué)適體傳感器選擇性較好，只對凝血酶特異性吸附。實驗對比結(jié)果如圖6所示。

3 結(jié)論

圖6 電化學(xué)適體傳感器的選擇性Fig.6The specificity of the proposed electrochemical aptasensor

該實驗基于pPdNPs和HCR的放大成功制備出一個高靈敏、無標(biāo)記的夾心式新型電化學(xué)適體傳感器用于TB的檢測。在實驗過程中，沉積的納米金有很大的比表面積和優(yōu)異的導(dǎo)電性，可固載更多TBAI并能加快電子的傳遞；同時，利用多孔鈀納米粒子大的表面積來固載更多的TBAII和S1；電極上的TBA捕獲溶液中的TB后，與pPdNs-TBAⅡ-S1組裝；再與S1、S2和電活性物質(zhì)MB的混合物通過雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，形成內(nèi)嵌有大量MB的雙鏈dsDNA，從而達(dá)到信號放大的效果。該適體傳感器具有檢測限低，靈敏度高，穩(wěn)定性強，制作簡單等優(yōu)點，在臨床診斷方面有一定的潛在應(yīng)用價值。

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A novel electrochemical aptasensor for thrombin detection based on hybridization chain reaction as enhanced signals

Peng De-min，Yuan Ruo*
（School of Chemistry and Chemical Engineering,Southwest University,Chongqing 400715,China）

Herein,we was prepared successfully a high-sensitivity and unlabeled sandwich-type electrochemical aptasensor for thrombin(TB)detection based on porous Nano-Palladium complexes(pPdNPs)and hybridization chain reaction(HCR).In the course of the experiment,Au nanoparticles electrodeposited(DpAu)had outstanding electrical conductivity to promote the electron transfer at the electrode interface and had good biocompatibility to load large amounts of thrombin binding aptamer(TBAI).Moreover,pPdNPs was employed to load large number of TBAIIand S1.In the present of TB,the TBAII-pPdNPs-S1was designed as the signal probe for the sandwiched aptasnesor.Then S1could trigger the HCR to lead to the formation of extended double-stranded DNA(dsDNA) polymers at the aid of S1and S2.To achieve detection of thrombin,a mass of redox probe,methylene blue(MB),was intercalated into the dsDNA polymers through specific interaction.According to the linearity between TB concentration and current response,we could quantitatively detect target TB.This work provided a promising strategy for the thrombin detection with high sensitivity and simple characteristics.

electrochemical aptasensor；thrombin；nanoparticle；hybridization chain reaction;porous Nano-Palladium complex(pPdNPs)

國家自然科學(xué)基金資助項目(21275119,21105081)

*通訊聯(lián)系人，Tel.:023-68252277,E-mail:yuanruo@swu.edu.cn