基于核酸適體和納米材料構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器用于多巴胺的檢測

廖妮,鄒雪

（攀枝花學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院,四川攀枝花 617000）

基于核酸適體和納米材料構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器用于多巴胺的檢測

廖妮*,鄒雪

（攀枝花學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院,四川攀枝花 617000）

該文探究了一種基于核酸適體和納米金包四氧化三鐵(Au@Fe3O4)納米粒子所構(gòu)建的新型電化學(xué)生物傳感器用于多巴胺(DA)的檢測。首先，在玻碳電極(GCE)表面電沉積一層納米金(nano-Au)用于多巴胺適體(DBA)的固定。然后HT做為封閉劑以減少非特異性吸附。接著通過與DBA的特異性結(jié)合將DA固載于電極表面。在EDC/NHS作用下，生物素(Bio)的羧基與DA的氨基結(jié)合，最后通過生物素與親和素特異性識別作用將含有電化學(xué)活性物質(zhì)硫堇的納米復(fù)合材料固定于電極表面，制得夾心型的適體傳感器。在最優(yōu)條件下，該傳感器對0.001 nmol/L～100 nmol/L DA的檢測具有良好的電流響應(yīng)，檢出限0.33 pmol/L(S/N=3)。該適體傳感器具有操作簡單、操作簡便、選擇性好、靈敏度高、檢測范圍廣、檢出限低的優(yōu)點。

電化學(xué)適體傳感器；多巴胺；金包四氧化三鐵；硫堇；生物素-親和素系統(tǒng)

0 引言

電化學(xué)生物傳感器發(fā)展至今[1]，提高其靈敏度和增強(qiáng)電極的響應(yīng)信號仍然是電化學(xué)傳感器研究探討的一項關(guān)鍵內(nèi)容。納米技術(shù)的出現(xiàn)為納米材料在生物大分子的組裝及生物傳感器[2～4]領(lǐng)域的應(yīng)用開辟了新的思路。納米材料[5～7]由于具有比表面積大、表面自由能高以及優(yōu)良的生物相容性等這些獨特的物理和化學(xué)性質(zhì)，使其在納米科學(xué)領(lǐng)域受到廣泛的重視，同時也推動了化學(xué)和生物傳感器的迅速發(fā)展。在生物傳感器的構(gòu)建及提高檢測的靈敏度方面，納米材料都顯示出卓越的優(yōu)勢。在納米修飾電極中，組裝的納米材料具有大的表面積，可以固載成百上千的信號分子，因而可以對檢測信號起到擴(kuò)增的作用。而細(xì)小的納米粒子可滲透到生物大分子內(nèi)部接觸到生物大分子的電活性中心，從而縮短生物大分子活性中心與電極表面的距離，加快直接電子傳遞的速度。同時納米粒子具有良好的生物兼容性，可以最大限度地保持蛋白質(zhì)與酶等生物分子的活性。該文擬以核酸適體[8～11]特異識別生物分子、納米材料提高生物組分的固定及放大信號，設(shè)計一類高靈敏度的電化學(xué)適體傳感器。在此基礎(chǔ)上還應(yīng)用到硫堇的雙氨基特性以及在pH=7.0的PBS底液中的氧化還原峰。此外，還利用了生物素-親和素系統(tǒng)結(jié)合牢固，多級放大效應(yīng)。從而使現(xiàn)象更加明顯，有利于對適體傳感器的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器

CHI600D電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)，超聲波清洗儀DS-1510DT(上海生析超聲器有限責(zé)任公司)，MP230酸度計(瑞士Metter Toledo公司)，AB204-S電子天平(瑞士Metter Toledo公司)。實驗采用三電極體系，修飾過的玻碳電極(GCE，Φ=4 mm)為工作電極，鉑電極為輔助電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極。

1.2 試劑

多巴胺適體(堿基序列為5′-SH-(CH2)6GTC TCT GTG TGC GCC AGA GAA CAC TGG GGC AGA TAT GGG CCA GCA CAG AAT GAG GCC C-3′)（生工生物工程，上海）；親和素(Avidin)（中國Bioss公司）；氯金酸(HAuCl4)，己硫醇(96%HT)，牛血清蛋白(BSA)，血紅蛋白(Hb)，硫堇(Thi)，生物素(Bio)(Sigma公司，美國)；多巴胺(DA)，三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(Tris-HCl)(Roche公司，瑞士)；磷酸緩沖溶液(PBS)，20 nmol/L Tris-HCl緩沖液(pH=7.4)用140 nmol/L NaCl+5 nmol/L KCl+1 nmol/L MgCl2制備。0.1 mol/L的磷酸緩沖液(pH= 7.4)用10 nmol/L Na2HPO4+10 nmol/L KH2PO4+2 nmol/L MgCl2制備，并用于整個實驗過程。相關(guān)試劑均為分析純，及時制備使用，實驗用水均為二次蒸餾水。

1.3 適體傳感器的制備

電化學(xué)適體傳感器的制備過程見圖1。首先分別用粒徑為0.3 μm和0.05 μm的Al2O3粉末對玻碳電極進(jìn)行打磨，然后在二次蒸餾水中超聲清洗3次（3 min/次）。然后將打磨干凈的電極在1%的HAuCl4溶液中在-0.2 V條件下進(jìn)行沉積30 s，然后在電極表面滴加20 μL的DBA溶液（2.5 μmol/L）在常溫下放置16 h，接著滴加20 μL的HT孵育1 h，以封閉非特異性吸附位點。然后在所修飾的電極表面滴加20 μL的DA孵育20 min（經(jīng)對其孵育時間的優(yōu)化確定），再加入20 μL的用EDC/NHS活化了羧基的生物素孵育30 min，最后加入20 μL的Au@Fe3O4/Thi/Avidin納米復(fù)合材料孵育30 min后即可測定。

圖1 適體傳感器的制備過程示意圖Fig.1The preparation of aptamer sensor process diagram

2 結(jié)果與討論

2.1 適體傳感器的分步表征

圖2 不同修飾電極的循環(huán)伏安表征。(a)裸玻碳電極；(b)nano-Au修飾的電極；(c)固定了DBA的電極；(d)HT封閉的電極；(e)結(jié)合DA的電極；(f)加入Bio的電極Fig.2Cyclic voltammograms in[Fe(CN)6]4-/3-buffer solution for(a)bare GCE；(b)nano-Au/GCE；(c)DBA/ nano-Au/GCE；(d)HT/DBA/nano-Au/GCE；(e)DA/HT/ DBA/nano-Au/GCE；(f)Bio/DA/HT/DBA/nano-Au/GCE

為保證電極進(jìn)行修飾時的修飾效果，分不同的步驟依次對電極進(jìn)行表征，測定不同步驟下電極的循環(huán)伏安行為。圖2為電極在5 mmol/L鐵氰化鉀（[Fe(CN)6]4-/3-）中的分步表征圖。曲線a為裸電極的循環(huán)伏安圖；曲線b表示沉積納米金后電極的循環(huán)伏安圖，此時由于納米金粒子對電子傳輸?shù)拇龠M(jìn)作用，得到增大的峰電流值；曲線c表示孵育了DBA后電極的循環(huán)伏安圖，因為適體的存在阻礙了電子的傳輸，使峰電流減??；曲線d表示加入HT后電極的循環(huán)伏安圖，由于HT封閉了電極上的非特異性吸附位點，因此峰電流繼續(xù)減?。磺€e表示加入10 nmol/L DA后電極的循環(huán)伏安圖，因為DA與DBA發(fā)生特異性結(jié)合將膜表面的微孔通道堵塞，阻礙了電子的傳遞，峰電流繼續(xù)減小。曲線f表示結(jié)合了生物后電極的循環(huán)伏安圖，DA與生物素在EDC/NHS作用下交聯(lián)縮合進(jìn)一步阻礙電子的傳遞，從而進(jìn)一步降低了響應(yīng)電流。由對電極修飾的逐步表征可知，該適體傳感器是成功制備了的。

2.2 孵育Au@Fe3O4/Thi/Avidin納米復(fù)合材料前后的電極表征

圖3為電極孵育Au@Fe3O4/Thi/Avidin納米復(fù)合材料前后在PBS（pH=7.0）中的表征圖。曲線a為加入Au@Fe3O4/Thi/Avidin納米復(fù)合材料前電極的循環(huán)伏安圖，此時在PBS中沒有出峰；曲線b為加入Au@Fe3O4/Thi/Avidin納米復(fù)合材料后電極的循環(huán)伏安圖，圖中可以明顯看到一對硫堇的氧化還原峰，說明此復(fù)合物被成功固載到了電極表面。

圖3 孵育Au@Fe3O4/Thi/Avidin納米復(fù)合材料前后的電極表征(a)加入Au@Fe3O4/Thi/Avidin之前的電極表征；(b)加入孵育Au@Fe3O4/Thi/Avidin納米復(fù)合材料之后的電極表征之后的電極Fig.3The aptasensors in the absence(a)and in the presence(b)of Au@Fe3O4/Thi/Avidin in 2 mL 0.1 mol/L PBS

2.3 多巴胺修飾時間的優(yōu)化

由于DBA與DA結(jié)合程度與其反應(yīng)時間相關(guān)，因此需實驗探究其最佳結(jié)合時間。該試驗研究了制備的傳感器加入20 μL 10 nmol/L DA分別孵育5、10、15、20、25 min，用循環(huán)伏安法測定其響應(yīng)電流的變化。圖4-A為不同孵育時間電極在[Fe(CN)6]4-/3-中的循環(huán)伏安圖；圖4-B為不同孵育時間電極的響應(yīng)電流差值的線性關(guān)系圖。如圖所示，峰電流值隨著孵育時間的增加而降低，到20 min往后基本變化不大。所以，實驗過程中選擇的最佳孵育時間為20 min。

2.4 適體傳感器的選擇性

在最佳實驗條件下，在PBS溶液(pH=7.0)中檢測以濃度為100 nmol/L的葡萄糖(glucose)，L-半胱氨酸(L-cys),尿酸(UA)，抗壞血酸(AA)以及蒸餾水(blank)孵育的電極的電流強(qiáng)度，并且與以10 nmol/L的DA孵育的電極的電流強(qiáng)度比較。結(jié)果如圖5所示。經(jīng)blank、glucose、L-cys、UA、AA孵育后的電極的電流強(qiáng)度遠(yuǎn)低于與DA作用后的電流強(qiáng)度，說明該適體傳感器對DA的檢測具有高度的選擇性。

圖4 孵育時間對電極性能的影響：圖A不同孵育時間電極的循環(huán)伏安圖；圖B不同孵育時間的線形關(guān)系圖Fig.4The effect of the different incubation time after the aptasensor incubated in 10 nmol/L DA solution in 5 mmol/L [Fe(CN)6]4-/3-solution(pH=7.0)at 100 mV/s．

圖5 傳感器的特異性測定Fig.5The selectivity of the aptasensor examined by being incubated in the following samples under the same experimental conditions：(a)0 nmol/L DA；(b)100 nmol/L glucose；(c)100 nmol/L L-cys；(d)100nmol/L UA；(e)100 nmol/L AA；(f)10 nmol/L DA

2.5 適體傳感器的重現(xiàn)性

所構(gòu)建的適體傳感器的重現(xiàn)性：5支同一批次修飾電極孵育相同濃度的1 nmol/L的多巴胺，所有的修飾電極表現(xiàn)出了相近的電化學(xué)響應(yīng)信號，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為5.49%，說明所構(gòu)建的傳感器具有可接受的重現(xiàn)性。

2.6 適體傳感器的實際應(yīng)用

為了評估所構(gòu)建的適體傳感器在臨床診斷的可行性，用標(biāo)準(zhǔn)添加的方法做了回收率實驗，即用稀釋的人體血清溶液配制了不同濃度的多巴胺溶液。檢測結(jié)果顯示回收率為94.9%～106%（如表1所示），在可接受的范圍內(nèi)，說明該生物傳感器在臨床診斷中具有一定的實際應(yīng)用價值。

表1 傳感器的加標(biāo)回收試驗Tab.1Determination of DA added in normal human serum with the proposed aptasensor

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A novel electrochemical aptasensor for sensitive detection of dopamine based on nucleic acid aptamer and nanomaterials

Liao Ni*,Zou Xue
(College of Biological and Chemical Engineering,Panzhihua University,Panzhihua 617000,China)

In this work,a novel strategy was constructed based on nucleic acid aptamer and nanomaterials for the sensitive detection of dopamine(DA).The thiolated dopamine binding aptamer(DBA)were firstly immobilized on the gold nanoparticles(nano-Au)modified glassy carbon electrodes(GCE).In the presence of target DA,the DBA could catch the DA onto the electrode surface.The anchored DA was then derivatized with biotin for the attachment of the conjugates which contain the electron media thionine to contrast a sandwich-type aptasensor.Under the optimal conditions,a wide detection range from 0.001 nmol/L to 100 nmol/L and a low detection limit of 0.33 pmol/L (defined as S/N=3)for DA were obtained.In addition,the sensor exhibited the advantages of simple operation,easy to operate,good selectivity,high sensitivity.

electrochemical aptasensor;dopamine;Au@Fe3O4;thionine;biotin-avidin system

*通訊聯(lián)系人，Tel:13158565767,E-mail：liaoni123456789@163.com