熒光光譜法在半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物鑒定中的應(yīng)用

張麗芳，李偉嶺，江兆玲，王 米，鄭文麗，薛飛群

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸藥安全評(píng)價(jià)與獸藥殘留研究重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)部寄生蟲病學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海 閔行區(qū)200241）

食品安全是目前全球最關(guān)注的一大熱點(diǎn)，農(nóng)藥和獸藥的不合理使用甚至濫用導(dǎo)致食用農(nóng)產(chǎn)品殘留超標(biāo)，已成為食品安全的突出問題之一，開發(fā)可靠、靈敏、快速和實(shí)用的快速分析檢測(cè)技術(shù)無(wú)疑是監(jiān)測(cè)和控制殘留、保障人民身體健康和避免國(guó)際間貿(mào)易爭(zhēng)端的重要前提。而免疫分析技術(shù)特別是酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)作為一項(xiàng)快速檢測(cè)技術(shù)，以其抗原抗體反應(yīng)的高專屬性，測(cè)定方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、費(fèi)用低和適于現(xiàn)場(chǎng)大批量樣品篩選等優(yōu)點(diǎn)，在農(nóng)藥獸藥殘留分析和環(huán)境檢測(cè)中展示了廣泛的應(yīng)用前景[1-4]。

免疫分析法是利用抗原和抗體的結(jié)合反應(yīng)的檢測(cè)方法，而大多數(shù)農(nóng)藥和獸藥都是小分子物質(zhì)（也叫半抗原），相對(duì)分子質(zhì)量在1 000 Da以下，它缺乏T細(xì)胞表位而無(wú)法直接誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生特異性的抗體，但把它以共價(jià)鍵方式偶聯(lián)到大分子蛋白載體上制備成人工抗原(也稱偶聯(lián)物)后，可借助其T細(xì)胞來(lái)間接誘導(dǎo)B細(xì)胞的增殖與分化，產(chǎn)生特異性的抗體，這也是小分子免疫分析的基本模式。在這項(xiàng)技術(shù)中，鑒定人工抗原（半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物）是否偶聯(lián)成功是建立免疫分析方法的前提和關(guān)鍵所在。目前半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的鑒定方法主要有紫外分光光度法[5]、紅外分光光度法[6]、電泳法[7-9]和基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜法[10-11]等等，到目前為止還沒見熒光光譜法應(yīng)用于半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的鑒定中的文獻(xiàn)報(bào)道。

目前熒光光譜法主要應(yīng)用于小分子與蛋白或其他生物大分子以非共價(jià)鍵相互作用方面的研究，而人工抗原是小分子半抗原與載體蛋白以共價(jià)鍵結(jié)合得到的偶聯(lián)物。本文以苯甲酸和苯胺為小分子半抗原分別與載體蛋白牛血清白蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，開展半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的熒光光譜鑒定的初步研究，試圖建立一種新的半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物鑒定的新方法。

1 儀器與試劑

熒光分光光度計(jì)（F-2500，日本日立公司）。所有試劑均為分析純?cè)噭ㄊ惺郏?/p>

2 半抗原－載體蛋白偶聯(lián)物的制備

2.1 苯甲酸-牛血清白蛋白偶聯(lián)物的制備 稱取0.12 g（1mmol/L）苯甲酸，加3mL 1，4-二氧六環(huán)，于4℃下加入0.14 g（1mmol/L）三丁胺和00.14 g(1 mmol/L)氯甲酸異丁酯攪拌30min，此為甲液。

稱取0.66 g（0.01mmoL）牛血清白蛋白（BSA）加50%二氧六環(huán)水溶液，此為乙液。將甲液滴加入乙液，4℃下攪拌過夜。將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移入透析袋，用磷酸pH緩沖液（pH值7.4）透析3 d，每天換液2次。取透析袋中絮狀物，真空冷凍干燥即得白色固體。

2.2 苯胺-牛血清白蛋白偶聯(lián)物的制備 稱取0.09 g（1mmol/L）苯胺，加3mL 1mol/L鹽酸，冰浴下攪拌滴加入1%NaNO2水溶液至淀粉碘化鉀試紙變藍(lán)，此為甲液。

稱取0.66 g（0.01mmol/L）牛血清白蛋白（BSA）加15mL碳酸鹽緩沖液（0.2mol/L，pH值9.6）水溶液溶解，此為乙液。于4℃下將甲液滴加入乙液，4℃下攪拌過夜。將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移入透析袋，用磷酸pH緩沖液（pH值7.4）透析3 d，每天換液2次。取透析袋中絮狀物，真空冷凍干燥即得棕色固體。

3 熒光光譜測(cè)定

分別取牛血清白蛋白、苯胺、苯甲酸、苯胺-牛血清白蛋白偶聯(lián)物和苯甲酸-牛血清白蛋白偶聯(lián)物適量加50%甲醇水溶液溶解成各試液，取各試液分別置于1 cm石英比色液池中，設(shè)置空白溶劑為50%甲醇水溶液，激發(fā)波長(zhǎng)為278 nm,激發(fā)和發(fā)射單色儀的狹縫寬度均為5 nm，掃描速度為300 nm/min，掃描范圍320～500 nm等條件進(jìn)行熒光發(fā)射光譜掃描測(cè)定。

4 結(jié)果與討論

4.1 激發(fā)波長(zhǎng)的確定 牛血清白蛋白因含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等具有熒光特性的氨基酸而顯示有熒光特征，苯甲酸和苯胺并不具有熒光特征，因此本文首先通過固定激發(fā)波長(zhǎng)來(lái)掃描牛血清白蛋白的發(fā)射光譜和固定發(fā)射波長(zhǎng)掃描牛血清白蛋白的激發(fā)光譜，摸索最佳的激發(fā)波長(zhǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在激發(fā)波長(zhǎng)278 nm下，牛血清白蛋白的熒光發(fā)射強(qiáng)度最強(qiáng)，為苯甲酸-牛血清白蛋白偶聯(lián)物和苯胺-牛血清白蛋白偶聯(lián)物的鑒定奠定基礎(chǔ)。

4.2 熒光光譜分析 圖1是牛血清白蛋白和苯胺-牛血清白蛋白偶聯(lián)物的熒光光譜圖。從圖1中可看出，苯胺-牛血清白蛋白偶聯(lián)物的最大發(fā)射波長(zhǎng)在350 nm，與牛血清白蛋白、苯胺及其兩者的混合物相比發(fā)生了明顯的位移，表明苯胺已被成功偶聯(lián)到牛血清白蛋白上了。

圖1牛血清白蛋白及其苯胺-牛血清白蛋白偶聯(lián)物的熒光光譜

圖2是牛血清白蛋白和苯甲酸-牛血清白蛋白偶聯(lián)物的熒光光譜圖。從圖2中可看出，苯甲酸-牛血清白蛋白偶聯(lián)物的最大發(fā)射波長(zhǎng)在320 nm處，其熒光發(fā)射圖譜與BSA及BSA與苯甲酸混合物的熒光光譜略有區(qū)別，因此也能斷定，苯甲酸已與牛血清白蛋白成功偶聯(lián)。

圖2牛血清白蛋白及其苯甲酸-牛血清白蛋白偶聯(lián)物的熒光光譜

在人工抗原的制備中，小分子以特定的基團(tuán)（如氨基-NH2、羧基-COOH等等）通過相應(yīng)的反應(yīng)連接到載體蛋白上。本研究中，苯胺通過氨基的重氮化法與牛血清白蛋白上的色氨基酸、酪氨基酸殘基等偶聯(lián)。由于牛血清白蛋白產(chǎn)生熒光主要也是這些氨基酸貢獻(xiàn)的，一旦有其他基團(tuán)連接上后，就改變了原來(lái)的熒光光譜特性。因此苯胺-牛血清白蛋白偶聯(lián)物的熒光光譜與其載體蛋白牛血清白蛋白的熒光光譜區(qū)別很大；而苯甲酸是通過其羧基以混合酸酐法與牛血清白蛋白上的伯氨基形成酰胺鍵而偶聯(lián)，因此其偶聯(lián)物的熒光光譜與其載體牛血清白蛋白的相比變化不大，只是在熒光發(fā)射強(qiáng)度上有一定的區(qū)別。

5 結(jié)論

經(jīng)過熒光光譜法鑒定結(jié)果初步表明，苯甲酸-牛血清白蛋白偶聯(lián)物和苯胺-牛血清白蛋白偶聯(lián)物合成成功。熒光光譜法簡(jiǎn)單、快速且靈敏，可望成為小分子-載體蛋白偶聯(lián)物鑒定的有效方法。

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