抗多藥耐藥靶點及相關(guān)藥物的研究進展

吳晨，徐竹軒，周啟蒙，支運寶，林克江

（中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210009）

抗多藥耐藥靶點及相關(guān)藥物的研究進展

吳晨，徐竹軒，周啟蒙，支運寶，林克江*

（中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210009）

抗多藥耐藥是指在疾病的治療過程中，細(xì)胞對多種藥物產(chǎn)生廣泛的耐受，導(dǎo)致治療效果不理想的現(xiàn)象。多藥耐藥多發(fā)于感染與腫瘤疾病的治療中，已成為治愈這2類疾病的主要障礙。從轉(zhuǎn)運蛋白和離子通道、酶以及核糖體這3個方面綜述抗多藥耐藥靶點的機制及相關(guān)藥物的研究進展，旨在為抗多藥耐藥藥物的研發(fā)提供參考。

多藥耐藥；感染；腫瘤；轉(zhuǎn)運蛋白；酶；核糖體蛋白

多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）是指在疾病的治療過程中，細(xì)胞對多種藥物產(chǎn)生廣泛的耐受，導(dǎo)致治療效果不理想的現(xiàn)象。多藥耐藥多發(fā)于感染與腫瘤疾病治療中，已成為治愈這2類疾病的重要障礙。目前多藥耐藥研究的難點在于耐藥性基因突變多樣性及機制的復(fù)雜性，導(dǎo)致藥物研發(fā)處于停滯狀態(tài)。因此，有必要對目前已知的多藥耐藥機制進行總結(jié)，為抗多藥耐藥藥物的進一步研發(fā)尋找突破口。

目前多藥耐藥主要機制可歸納為以下2類[1]。1）減少水溶性藥物經(jīng)轉(zhuǎn)運體攝入細(xì)胞的量以及增加細(xì)胞向外泵出藥物的能力。與此相關(guān)的主要有轉(zhuǎn)運蛋白和離子通道，其中轉(zhuǎn)運蛋白主要為ATP結(jié)合盒（ATP-binding cassette，ABC）轉(zhuǎn)運蛋白超家族，其包括P-糖蛋白（P-gp）、多藥耐藥相關(guān)蛋白1（MRP1）和乳腺癌抗性蛋白（BCRP）；離子通道以鉀離子通道為主。2）細(xì)胞自身發(fā)生改變，降低細(xì)胞毒性藥物的效果，與此相關(guān)的功能蛋白，包括影響細(xì)胞周期、增加DNA和RNA損傷后修復(fù)、減少凋亡和影響藥物代謝的酶類[如DNA解旋酶（DNA gyrase）、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶（DNA Topoisomerase）、二氫葉酸合酶（dihydropteroate synthase，dhpS）、烯酰ACP還原酶、β-內(nèi)酰胺酶（β-lactamase，BL）、蛋白激酶類]，以及核糖體及其相關(guān)蛋白。此外，還有一些潛在的耐藥性靶點如脂蛋白（LPS）、膜黏附蛋白、Toll樣受體（TLR）等（見圖1）。本文對多藥耐藥相關(guān)靶點及藥物的研究進展進行綜述，旨在為抗多藥耐藥藥物的進一步研發(fā)提供參考。

圖1 細(xì)菌感染中的多藥耐藥靶點Figure 1 The multidrug resistant targets in bacterial infections

1 轉(zhuǎn)運蛋白與離子通道

轉(zhuǎn)運蛋白與離子通道，其共同的功能是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的運輸。不同轉(zhuǎn)運蛋白對運輸?shù)孜锏倪x擇性存在差異，有專一性的，也有非特異性的，轉(zhuǎn)運蛋白功能的異?？山档退幬锏挠行舛?，從而導(dǎo)致耐藥，是研究多藥耐藥的主要靶點。

1.1 ABC轉(zhuǎn)運蛋白超家族

ABC轉(zhuǎn)運蛋白超家族（ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白，ATP-binding cassette transporters，簡稱ABC transporters），在多藥耐藥中占有重要地位。其結(jié)構(gòu)上的功能性區(qū)域包括跨膜區(qū)（transmembrane domain，TMD）和核苷（如ATP）結(jié)合區(qū)（nucleotide-binding domain，NBD）[2]。NBD域與ATP結(jié)合后，TMD域的螺旋結(jié)構(gòu)打開一個小孔，推動底物向外排出[3]。

人類共有48個基因編碼ABC轉(zhuǎn)運蛋白，分為A～G共7個亞族[4]。ABC轉(zhuǎn)運蛋白作用范圍廣泛，從正常代謝產(chǎn)物到化療藥物均可為其所轉(zhuǎn)運，同時眾多ABC互相協(xié)作構(gòu)成復(fù)雜的轉(zhuǎn)運網(wǎng)絡(luò)。ABC轉(zhuǎn)運蛋白有選擇性地在刷狀腸道細(xì)胞、膽汁微管的肝細(xì)胞、腎近端小管、血腦屏障的上皮細(xì)胞等重要的生理屏障中高度表達(dá)，參與多種生理過程，例如脂類代謝、體內(nèi)離子平衡和免疫功能等（見圖2）。引起MDR的ABC轉(zhuǎn)運蛋白集中于ABCB亞族、ABCC亞族、ABCG亞族，具有代表性的成員包括P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp，ABCB1），多藥耐藥相關(guān)蛋白（multidrug resistance associated-protein 1，MRP1，ABCC1） 以 及 乳 腺 癌抗 性 蛋 白（breast cancer resistance protein，BCRP，ABCG2）。

圖2 ABC轉(zhuǎn)運蛋白超家族成員的分布Figure 2 The location of ABC transporters family members

1.1.1 ABCB亞族 ABCB亞族的代表是ABCB1，也常稱為P-糖蛋白、P-gp或MDR1?；熤械闹鲗?dǎo)藥物，包括長春花生物堿類、蒽環(huán)類藥物、表鬼臼毒素和紫杉烷，都能被ABCB1轉(zhuǎn)運。維拉帕米可以抑制ABCB1[5]，從而增強此類細(xì)胞毒藥物對于ABCB1高表達(dá)細(xì)胞的殺滅效果。

此外該亞族中，ABCB11[6-7]和ABCB4（MDR3）[8-9]在肝臟中表達(dá)，前者轉(zhuǎn)運膽鹽，后者轉(zhuǎn)運磷脂酰膽堿固醇。人工表達(dá)ABCB11，可讓細(xì)胞獲得對紫杉醇的耐藥性[10]；而ABCB4可以促進地高辛、紫杉醇和長春堿的轉(zhuǎn)運[11]。

目前針對ABCB類研發(fā)的藥物不多，當(dāng)前在研的9個藥物中8個處于生物活性測試階段，均為ABCB1抑制劑。其中，有3個藥物抑制ABCB1的同時還可抑制ABCG2。唯一1個進入臨床前階段的藥物由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院研發(fā)，具有多重作用機制，包括ABCB1表達(dá)抑制作用、自噬誘導(dǎo)作用、組蛋白脫乙酰酶SIRT1抑制作用、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用、血管生成抑制作用。綜上所述，ABCB1是較有開發(fā)前景的靶標(biāo)，ABCB11和ABCB4也有待進一步研究。

1.1.2 ABCC亞族 ABCC亞族蛋白在結(jié)構(gòu)上較ABCB多出一個特征性的鏈接區(qū)（linker region）。ABCC成員可以轉(zhuǎn)運有機陰離子和藥物的Ⅱ相代謝產(chǎn)物，與藥物Ⅰ相/Ⅱ相代謝的酶系聯(lián)合作用，為細(xì)胞提供了強大的藥物消除能力。

ABCC1即MRP1，在多種組織如腫瘤中表達(dá)。MRP1以疏水藥物為底物，還以谷胱甘肽、葡萄糖醛酸和硫酸結(jié)合的藥物二次代謝后產(chǎn)物為底物。與ABCC1同源的ABCC2（MRP2）則參與藥物的膽汁排泄，常引起口服藥物的耐藥[12]；ABCC3（MRP3）常與葡萄糖醛酸復(fù)合物結(jié)合[13]，可能參與藥物的肝腸循環(huán)[14]；人工轉(zhuǎn)染ABCC6（MRP6）可使細(xì)胞產(chǎn)生對依托泊苷、替尼泊苷、阿霉素和柔毛霉素等天然產(chǎn)物的耐藥性[15]；ABCC10（MRP7）可促使細(xì)胞對紫杉醇耐藥[16]。

針對腫瘤耐藥，以ABCC1為靶點的藥物研究較多?，F(xiàn)報道的30個藥物中，已有環(huán)香草酮（cyclovalone）上市，多非喹達(dá)（dofequidar）進入Ⅲ期臨床研究階段。也有研究者使用依氟鳥氨酸、舒林酸、奧美拉唑和酮洛芬等早已上市的藥物，通過調(diào)控ABCC基因，直接從源頭調(diào)節(jié)ABCC蛋白的表達(dá)，從而達(dá)到抑制耐藥性的目的。目前，ABCC1作為抗耐藥性靶標(biāo)，已成為抗腫瘤藥研究熱點之一。

1.1.3 ABCG亞族 ABCG2（MXR/BCRP）與癌細(xì)胞耐藥呈明顯相關(guān)性。ABCG2轉(zhuǎn)運底物包括細(xì)胞毒藥物，食物中的致癌物及內(nèi)源性物質(zhì)[17-18]。ABCG2不僅可以運輸甲氨蝶呤，還可轉(zhuǎn)運谷氨酸。對于甲氨蝶呤，ABCG2可產(chǎn)生抗性[19]。ABCG2亦可轉(zhuǎn)運酪氨酸激酶抑制劑等較新品種抗癌藥[20]。

目前針對腫瘤耐藥，以ABCG2為靶點的藥物多達(dá)82個，自2011年起至今有4個藥物上市，其作用范圍較廣，涉及不止一個靶標(biāo)。其余有70余個藥物處于生物活性測試階段，且具有較好的應(yīng)用前景。

1.1.4 非特異亞型ABC 除了以上介紹的3個亞族外，其他的亞族合稱為非特異亞型ABC，其代表為ABCA2。細(xì)胞篩選實驗表明，ABCA2是導(dǎo)致雌莫司汀和米托蒽醌耐藥的主要原因，ABCA2的表達(dá)水平與機體對藥物的敏感性密切相關(guān)。目前對其他亞型的研究還不多，但可以確定的是非特異亞型ABC的表達(dá)能夠降低腫瘤細(xì)胞對藥物的敏感性[21]。此外，非特異亞型ABC也與抗菌藥物耐藥性的產(chǎn)生相關(guān)。

本類藥物的開發(fā)尚不多見：針對原核生物感染，當(dāng)前有3個藥物正在研發(fā)中；針對MDR腫瘤，有7個藥物處于生物活性測試階段，有1個進入臨床前研究階段，其中2個藥物除了作用于ABC外，還可分別抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ和cGMP磷酸二酯酶活性。

1.2 鉀離子通道

鉀離子通道是生物膜上種類最多，分布最廣，最復(fù)雜的一類離子通道，多具有ATP依賴性。根據(jù)鉀離子通道亞單位蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，將其劃分為3大類：1）含6個跨膜區(qū)單孔的電壓門控式鉀離子通道；2）含2個跨膜區(qū)單孔內(nèi)向整流鉀離子通道；3）含4個跨膜區(qū)雙孔的鉀離子通道。鉀離子通道通過控制鉀泵的開放與關(guān)閉改變膜內(nèi)外離子平衡，進而改變膜電位，引起鈣離子相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變和相關(guān)應(yīng)激反應(yīng)。

有研究表明，離子通道蛋白過度表達(dá)可能是導(dǎo)致腫瘤治療效果不佳的原因。已有報道稱強心類固醇如cardenolides和bufadienolides以Na+-K+-ATP酶的α亞基為靶點，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外K+濃度，改變膜電位從而影響腫瘤細(xì)胞的生命活動。強心類固醇藥物對非小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤和腎癌的治療效果變差與Na+-K+-ATP酶α亞基的過度表達(dá)相關(guān)，表明鉀離子通道相關(guān)蛋白是腫瘤細(xì)胞耐藥性產(chǎn)生的原因之一[22]。

鉀離子通道與細(xì)菌多藥耐藥的相關(guān)性研究主要在結(jié)核分枝桿菌中展開[23]。研究已經(jīng)確認(rèn)，鉀離子通道抑制劑如維拉帕米、利舍平和烏本（箭毒）苷（ouabain）可以通過抑制吞噬體-溶酶體復(fù)合物中離子泵的K+外流，增強殺菌藥物的效果，從而改善結(jié)核分枝桿菌的多藥耐藥問題。

目前還沒有針對鉀離子通道的抗腫瘤多藥耐藥性的上市藥物，相關(guān)機制還有待研究。在抗多藥耐藥菌藥物的研究方面，針對鉀離子通道的藥物達(dá)托霉素已于2011年上市，適應(yīng)證為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）引發(fā)的感染。離子泵（尤其是鉀離子通道）是頗具前景的多藥耐藥靶點。

2 酶

細(xì)菌和腫瘤細(xì)胞中酶類的改變也是導(dǎo)致耐藥性的重要因素，編碼酶的基因發(fā)生突變是耐藥性產(chǎn)生的根本原因。目前已明確的與耐藥性相關(guān)的酶包括：DNA解旋酶、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ、二氫葉酸合成酶、烯酰ACP還原酶、β-內(nèi)酰胺酶和蛋白激酶。

2.1 DNA解旋酶

DNA解旋酶（DNA gyrase）廣泛存在于細(xì)菌細(xì)胞中，其作用是在DNA分子中直接引入負(fù)超螺旋。負(fù)超螺旋化對DNA復(fù)制起始及促進DNA與起始蛋白結(jié)合有重要作用。DNA解旋酶由2個亞基——gyrA和gyrB組成，其中g(shù)yrA亞基具有DNA結(jié)合功能，被認(rèn)為是氟喹諾酮類藥物的靶點，氟喹諾酮類藥物通過與解旋酶、DNA生成復(fù)合物起效；而gyrB則起到與ATP結(jié)合、水解作用，并可被香豆素類化合物抑制[24]。

喹諾酮類藥物耐藥性產(chǎn)生與DNA解旋酶亞基gyrA和gyrB突變有關(guān)。其中g(shù)yrA突變概率較gyrB大，主要發(fā)生在67至106位氨基酸之間。其中Ser83與Asp87是最常突變的2個位點，為喹諾酮耐藥性決定區(qū)域（quinolone resistance-determining region，QRDR）。Ser83Trp突變能抑制喹諾酮類藥物諾氟沙星與解旋酶-DNA復(fù)合物結(jié)合。因此，gyrA中QRDR氨基酸改變導(dǎo)致喹諾酮結(jié)合位點結(jié)構(gòu)改變，藥物與修飾過的酶-DNA復(fù)合物親和力降低，從而產(chǎn)生耐藥性。

gyrB突變主要發(fā)生在426或447位氨基酸上，即：Asp426Asn 和Lys447Glu。在第一類突變中，426位負(fù)電荷消失，這一改變導(dǎo)致喹諾酮藥物的疏水正電性基團與位點親和力下降；第二類突變中447位電荷由正變負(fù)，疏水性降低，gyrB與喹諾酮結(jié)合能力減弱[25]。

除喹諾酮結(jié)合位點的直接突變外，gyrB其他位點的突變與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ ParE突變共同導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生。單位點的突變導(dǎo)致的耐藥性較弱，多位點突變是導(dǎo)致耐藥性的主要原因，這也是研發(fā)抗耐藥性藥物困難的因素之一[26]。

目前已上市的莫西沙星以DNA解旋酶為靶點，對多種多藥耐藥的革蘭陰性菌有效；GSK-2140944處于臨床前研究階段，主要針對MRSA。可見，DNA解旋酶是對抗多藥耐藥菌的有效靶點。針對這一靶點研發(fā)新廣譜抗生素將有助于解決多藥耐藥問題。

2.2 DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ

細(xì)菌DNA合成、mRNA的轉(zhuǎn)錄以及細(xì)胞分裂都涉及拓?fù)洚悩?gòu)酶催化染色體超螺旋調(diào)節(jié)機制，包括DNA雙鏈的斷裂和重組過程。這些過程被研究人員認(rèn)為是抗菌藥物的靶點。以喹諾酮類藥物為例，其以DNA-拓?fù)洚悩?gòu)酶復(fù)合物為作用靶點，生成喹諾酮-拓?fù)洚悩?gòu)酶-DNA復(fù)合物，通過抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ使DNA雙鏈維持在斷裂狀態(tài)并阻礙其重組，從而達(dá)到破壞染色體拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的目的。

拓?fù)洚悩?gòu)酶引發(fā)的耐藥性機制如圖3所示。拓?fù)洚悩?gòu)酶被抑制后細(xì)胞產(chǎn)生活性氧（ROS），導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂并引起DNA應(yīng)激反應(yīng)（SOS應(yīng)答）。在此過程中DNA損傷激活RecA并引起阻遏蛋白lexA自我分裂，從而誘導(dǎo)SOS應(yīng)答基因表達(dá)DNA修復(fù)酶，使得拓?fù)洚悩?gòu)酶功能恢復(fù)。值得注意的是，幾項研究已經(jīng)表明抑制SOS應(yīng)答不僅可以提高喹諾酮藥效，還可以通過阻礙易出錯DNA聚合酶的產(chǎn)生以及耐藥性因子的同源重組和橫向轉(zhuǎn)移進而減少耐藥性突變的發(fā)生[27]。

圖3 拓?fù)洚悩?gòu)酶引發(fā)的多藥耐藥機制Figure 3 The multidrug resistance mechanism induced by topoisomerase

莫西沙星同時以DNA解旋酶和DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ為靶點，對多種多藥耐藥的革蘭陰性菌有效。上述2種酶具有研究前景，新藥開發(fā)可以同時以這2種酶作為研究對象。

2.3 二氫葉酸合酶

dhpS是細(xì)菌葉酸合成的關(guān)鍵酶?；前奉愃幬镆约?xì)菌dhpS為作用靶點?；前奉愃幬锱cdhpS底物——對氨基苯甲酸（PABA）結(jié)構(gòu)相似，可與其競爭性結(jié)合dhpS，從而達(dá)到抑制dhpS的作用。

磺胺類藥物引發(fā)耐藥性的主要原因為編碼dhpS的基因FolP發(fā)生突變，導(dǎo)致dhpS結(jié)構(gòu)變化。不同類別的菌株發(fā)生突變的位點不同。例如，在大腸桿菌菌株中，dhpS的28位苯丙氨酸（Phe）突變?yōu)榱涟彼幔↙eu）；彎曲桿菌有4個氨基酸殘基發(fā)生突變，突變方式分別為L186F、D238N、N245K和F246Y；而在金黃色葡萄球菌中則有14個氨基酸與耐藥性產(chǎn)生相關(guān)[28]。

磺胺類藥物另一耐藥性機制發(fā)生在革蘭陰性腸道細(xì)菌中，由質(zhì)粒傳遞基因SUL1和SUL2產(chǎn)生。在SUL1和SUL2基因作用下產(chǎn)生的dhpS能很好地區(qū)別PABA與磺胺藥。

以dhpS為靶點的藥物有復(fù)方增效磺胺，目前已進入Ⅲ期臨床研究，研究表明其對MRSA引發(fā)的感染有效。

2.4 烯酰ACP還原酶

烯酰ACP還原酶有4種同工酶，即FabI、FabK、FabL、FabV，分布于不同種屬的細(xì)菌中。FabI是細(xì)菌合成脂肪酸的關(guān)鍵酶。在催化細(xì)菌脂肪酸循環(huán)（FASII）的最后一步反應(yīng)中，反式-2-脂烯?；鵄CP的碳碳雙鍵被NADH依賴型FabI酶催化還原，產(chǎn)生?；?ACP，此酶為脂肪酸合成反應(yīng)的限速酶。三氯生（TCL)靶向作用于烯?；孜锝Y(jié)合口袋，極大地提高FabI與NAD+的親和力，并與兩者形成穩(wěn)定的FabI-NAD+-TCL三元復(fù)合物。而TCL與酰基底物結(jié)合口袋的穩(wěn)定結(jié)合需要FabI與輔因子NAD+相互作用。

TCL耐藥性的產(chǎn)生主要由FabI錯義突變引起。當(dāng)93位氨基酸突變（G93V）后，TCL無法繼續(xù)不可逆結(jié)合FabI[G93V]底物結(jié)合口袋，同時NAD+與FabI[G93V]結(jié)合能力也大大降低。TCL既不可繼續(xù)作為FabI[G93V]終止抑制劑，也不可與FabI[G93V]、NAD+形成穩(wěn)定的三元復(fù)合物。細(xì)菌FabI[G93V]與底物烯?；鵄CP恢復(fù)結(jié)合，脂肪酸恢復(fù)合成，細(xì)菌從而產(chǎn)生耐藥性[29]。

以烯酰ACP還原酶（FabI）為靶點的藥物有CG-400549，目前已進入Ⅱ期臨床研究，其對MRSA引發(fā)的感染有效。

2.5 β-內(nèi)酰胺酶

β-內(nèi)酰胺酶能夠水解藥物分子中的β-內(nèi)酰胺四元環(huán)，作用于臨床上廣泛使用的一大類以青霉素、頭孢菌素為代表的β-內(nèi)酰胺抗生素，使其水解從而喪失抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成的作用。隨著β-內(nèi)酰胺抗生素在臨床上的廣泛使用，編碼β-內(nèi)酰胺酶的基因可發(fā)生替換和重組，這些變化可借助質(zhì)粒等基因載體在不同菌株中傳播，引起廣泛和強力的耐藥現(xiàn)象。β-內(nèi)酰胺酶突變已成為現(xiàn)今細(xì)菌多藥耐藥的重要原因。

β-內(nèi)酰胺酶根據(jù)一級結(jié)構(gòu)分為A～D四大類。A、C、D類酶催化中心為絲氨酸，B類催化中心則由鋅離子構(gòu)成。與通常位于染色體中的B、C類β-內(nèi)酰胺酶基因不同，編碼A、D類β-內(nèi)酰胺酶的基因多存在于細(xì)菌轉(zhuǎn)座子或質(zhì)粒上，因此更易于在不同菌株間傳播，引起大范圍的耐藥。A和D類β-內(nèi)酰胺酶作用底物廣泛，對多種抗生素甚至是新型抗生素均有效，也被稱為廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended-spectrum β-lactamases，ESBLs）[30]。ESBLs尚無標(biāo)準(zhǔn)化的命名法，常見的類別有：SHV、TEM、OXA、IMP、VIM、KPC等。也有一些罕見的ESBLs，目前只在個別區(qū)域的少數(shù)菌株中發(fā)現(xiàn)。以下僅介紹現(xiàn)今臨床影響較為廣泛的幾種ESBLs。

2.5.1 TEM型ESBLs（A類） 目前確證的TEM多達(dá)130種，以TEM-1為代表，在保留酶活性的前提下，其活性中心附近的氨基酸可以發(fā)生多種變化[31]，這些突變擴大了TEM底物的范圍，可引起包括氧基亞氨基β-內(nèi)酰胺抗生素（oxyimino-β-lactams）在內(nèi)的抗生素的耐藥[32]。常見的TEM型ESBLs還有TEM-10、TEM-12和TEM-26。

2.5.2 SHV型ESBLs （A類） SHV型ESBLs的整體結(jié)構(gòu)與TEM相似[33]。以SHV-1為例，其與TEM-1有68%的同源性，在活性位點附近亦有可變的氨基酸。SHV-5、SHV-12是臨床中最常見的SHV型ESBLs。

2.5.3 CTX-M型ESBLs（A類） 一 些 常 見 的A類ESBLs，既不屬于SHV型，又不屬于TEM型，研究人員將其統(tǒng)稱為CTX-M型，意為“善于水解頭孢噻肟（cefotaxime）”?，F(xiàn)已確證有40余種CTX-M型ESBLs[34]，其中傳播最為廣泛的有CTX-M-14、CTX-M-3、CTX-M-2等。

2.5.4 OXA型ESBLs（D類） OXA型ESBLs得名于“水解苯甲異唑青霉素（oxacillin）”。該類β-內(nèi)酰胺酶中主要成員有 OXA-1、OXA-2、OXA-10，通過氨基酸替換突變，現(xiàn)已確證了20種OXA。大多數(shù)OXA型ESBLs可引起細(xì)菌對頭孢他啶耐藥，此外還可引起克拉維酸耐藥。

2.5.5 質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC（C類） AmpC屬于C類β-內(nèi)酰胺酶，起源并編碼于數(shù)種革蘭陰性菌染色體中。然而隨著微生物相互“交流”，目前已有20余種AmpC被發(fā)現(xiàn)存在于細(xì)菌質(zhì)粒中[35]。AmpC可引起頭霉素、氧基亞氨基β-內(nèi)酰胺抗生素和克拉維酸的耐藥。

2.5.6 碳青霉烯酶（A、B、D類） 碳青霉烯酶（carbapenemases）包括IMP、VIM、KPC幾類，它們可引起氧基亞氨基頭孢菌素（oxyimino-cephalosporins）和頭霉素耐藥，且耐受碳青霉烯類抗生素[36]。IMP有17種，得名于該類酶耐受亞胺培南（imipenem）。VIM（Verona integron-encoded metallo-β-lactamase）屬于B類，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)有10種。KPC 則是Klebsiella pneumoniae carbapenemase的縮寫，屬于A類，由質(zhì)粒編碼。

2.6 蛋白激酶C

蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）為絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與細(xì)胞內(nèi)多條信號通路?；谒鼈兊慕Y(jié)構(gòu)和活化劑不同，蛋白激酶C可分為3個亞族：經(jīng)典PKCs、新型PKCs和非典型PKCs。其表達(dá)水平與ABC家族的表達(dá)及細(xì)胞凋亡水平相關(guān)，可使細(xì)菌產(chǎn)生多藥耐藥性。

經(jīng) 典PKCs包 括PKCα、PKCβ Ⅰ、PKCβ Ⅱ、PKCγ，具有鈣依賴性，并由第二信使——二?；视停―AG）所激活。新型PKCs是非鈣依賴的，仍由DAG所激活，包括PKCδ、PKCε、PKCη、PKCθ。而非典型PKCs既不是鈣依賴的，也不由DAG作為最佳激動劑，而是由脂質(zhì)組分（如磷脂酰肌醇、磷脂酸、花生四烯酸和神經(jīng)酰胺）激活。非典型PKCs包括PKCι、PKCτ和PKCζ等。

3種亞族的性質(zhì)差異由其結(jié)構(gòu)特點所決定。3種亞族均由C端底物結(jié)合催化結(jié)構(gòu)域與N端PS結(jié)構(gòu)域組成。經(jīng)典PKCs具有鈣離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域C2，這是其鈣依賴特點的來源，也是經(jīng)典PKCs與新型PKCs的唯一區(qū)別。非典型PKCs保守DAG結(jié)合結(jié)構(gòu)域C1不完整，故而沒有DAG激活的能力。非典型PKCs的PB1結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)識別PAR-6、 ZIP/p62和絲裂原蛋白激酶5（MEK5）的OPCA基序，NLS和NES分別是核定位序列與核外排序列，均與PKCs 功能相關(guān)。與耐藥性相關(guān)的PKCs主要是PKCα、PKCζ和PKCδ。

2.6.1 PKCα PKCα通過3個方面來增強細(xì)胞的耐藥性：減少由Gαq介導(dǎo)、磷脂酶C（PLC）-β催化生成的活性氧自由基（ROS）；通過磷酸化反應(yīng)調(diào)節(jié)抗凋亡蛋白與促凋亡蛋白的表達(dá)；抑制PARP的切割活性以對抗凋亡[37]。PKCα還可調(diào)節(jié)MRP2活性：外排泵MRP2/ ABCC2定位到細(xì)胞膜極性側(cè)才能發(fā)揮其外排活性，而負(fù)責(zé)連接細(xì)胞膜與細(xì)胞骨架的埃茲/根/膜突（ezrin/ radixin/moesin，ERM）蛋白家族中根蛋白（radixin）的C端磷酸化與MRP2定位過程相關(guān)，PKCα則參與根蛋白的磷酸化過程。在該通路中PKCα的活性又可由叔丁基氫過氧化物（t-BHP）誘導(dǎo)的GSH含量下降所激活[38]（見圖4）。而用谷胱甘肽乙酯（GSH-EE）誘導(dǎo)GSH含量恢復(fù)，通過PKA/cAMP通路使根蛋白磷酸化，進而使MRP2定位到細(xì)胞膜上。

圖4 PKCα引起的多藥耐藥機制Figure 4 Multidrug resistance mechanism caused by PKCα

類似于上述機制，在傷寒沙門氏菌感染的消化道上皮細(xì)胞，病原菌感染的信號通過PKAα使埃茲蛋白567位蘇氨酸磷酸化，協(xié)同MRP2定位在細(xì)胞膜極性側(cè)，完成將趨化因子HXA3外排引導(dǎo)多形核白細(xì)胞（PMN）遷移至患處的功能。通過以上機制可知，PKCα在GSH-PKC/PKA-ERM-MRP2信號通路發(fā)揮重要作用，使細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性[39]。

2.6.2 PKCζ PKCζ定位于細(xì)胞膜且會從細(xì)胞核中外排，但在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，如細(xì)菌感染或吸煙可導(dǎo)致ROS積累，PKCζ會被重分布到細(xì)胞核，重新分布到細(xì)胞核的PKCζ通過多條與維持細(xì)胞增殖相關(guān)的信號通路，促使細(xì)胞擺脫增殖抑制因子的抑制作用，調(diào)整細(xì)胞能量代謝結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞利于轉(zhuǎn)移，協(xié)助完成對細(xì)胞凋亡的耐受性，從而獲得多藥耐藥性（見圖5）[40]。

圖5 PKCζ耐藥性機制Figure 5 Drug resistance mechanism of PKCζ

2.6.3 PKCδ Wnt/β-catenin通路中的G蛋白偶聯(lián)受體Frizzled 1（FZD 1）激活后上調(diào)PKCδ，PKCδ又會激活A(yù)P-1活性，AP-1激活其下游基因c-JUN和c-FOS，從更長遠(yuǎn)的效應(yīng)來說，又會進一步激活肝細(xì)胞生長因子（HGF）與早期生長反應(yīng)基因1（EGR1），EGR1作為轉(zhuǎn)錄因子會影響ABCB1的表達(dá)（見圖6），從而促使細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。另外，HGF/EGR1的自分泌效應(yīng)會對抗細(xì)胞的自噬以及凋亡，增加腫瘤細(xì)胞的存活能力及耐藥能力。總之，PKCδ通過調(diào)節(jié)ABCB1的表達(dá)及對抗凋亡從而導(dǎo)致細(xì)胞多藥耐藥[41]。

圖6 PKCδ引發(fā)多藥耐藥的機制Figure 6 Multidrug resistance mechanism caused by PKCδ

PKC相關(guān)的抑制劑已有數(shù)個處于臨床前研究階段：Rottlerin作為PKCδ的特異性抑制劑，可以誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡；G?6976作為PKCα與β Ⅰ的抑制劑，可誘發(fā)癌細(xì)胞凋亡，同時減少ABCB1在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)；Ro-318220作為一種廣泛的PKC抑制劑可以抑制腫瘤細(xì)胞生長。另外，湯森路透Integrity數(shù)據(jù)庫中提到了2013年上市的頭孢曲松/舒巴坦的復(fù)方制劑，推測其部分機制可能是作為PKC抑制劑來治療多重耐藥的革蘭陰性菌感染。

目前，PKC依然是研究較多的靶點，具有很大的開發(fā)潛力。機制研究表明，PKC主要從2個方面影響多藥耐藥性：一是通過調(diào)節(jié)下游ABC家族轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)調(diào)節(jié)外排作用，二是通過對細(xì)胞凋亡信號通路的影響（ROS的清除及相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)控）調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡能力?？傮w來說，針對PKC的活性化合物，盡管發(fā)現(xiàn)時間早、研究時間長，但研發(fā)難度較大。

3 核糖體

核糖體是蛋白質(zhì)基因翻譯的重要場所，因而對病原微生物和細(xì)胞的存活有重要意義。原核生物核糖體由2個核糖核蛋白亞基50S和30S組成，與真核生物核糖體有差異。相應(yīng)的蛋白質(zhì)合成抑制劑類抗生素也分為2個子類：30S亞基抑制劑和50S亞基抑制劑。

3.1 30S核糖體亞基

30S核糖體抑制劑包括四環(huán)素類抗生素和氨基環(huán)醇兩類。四環(huán)素類抗生素通過阻止氨酰-tRNA與核糖體受體A位點結(jié)合而起效，氨基環(huán)醇包括大觀霉素和氨基糖苷類（如鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素）兩類抗生素。它們與30S核糖體亞基中的16S核糖體RNA結(jié)合。大觀霉素通過抑制延伸因子催化的移位反應(yīng)干擾肽酰tRNA與核糖體結(jié)合穩(wěn)定性，但不導(dǎo)致蛋白質(zhì)錯譯。相比之下，氨基糖苷類與30S核糖體中的16S rRNA的相互作用則能導(dǎo)致mRNA密碼子與其同源電荷酰胺-tRNA復(fù)合物在核糖體A位的構(gòu)象發(fā)生改變，從而引起tRNA錯配和蛋白錯譯。

7種tet和1種otr環(huán)質(zhì)?；虻哪退幮詸C制是通過產(chǎn)生核糖體保護蛋白，使核糖體免受四環(huán)素類抗生素作用。核糖體保護蛋白為延長因子EF-Tu和EF-G的同源蛋白，其同源性在包含GTP結(jié)合區(qū)域的N末端尤為顯著。Tet(M)和Tet(O)是機制較為清楚的兩類核糖體保護蛋白。實驗證實，兩者依賴核糖體的GTP激酶活性。由于Tet (M)蛋白和EF-G有重疊結(jié)合位點，兩者可競爭性結(jié)合核糖體。Tet (M)蛋白并不能取代EF-Tu及EF-G起延長肽鏈作用。因Tet (M)蛋白與核糖體親和力更強，其先與核糖體結(jié)合，之后被釋放并允許EF-G結(jié)合。當(dāng)Tet (M)、Tet (O)蛋白和GTP同時存在時，四環(huán)素類抗生素與30S亞基結(jié)合能力下降并從核糖體釋放。GTP在GTP激酶作用下水解釋放能量導(dǎo)致核糖體構(gòu)象改變，這一改變不影響正常蛋白質(zhì)翻譯過程，卻阻止四環(huán)素與30S核糖體結(jié)合[42]。

氨基糖苷類抗生素是放線菌的代謝產(chǎn)物。放線菌對自身產(chǎn)生的氨基糖苷類抗生素具有固有耐藥性。許多情況下這一耐藥性的產(chǎn)生與核糖體保護機制有關(guān)。16S rRNA A位特定核苷酸甲基化將會阻礙氨基糖苷類抗生素與30S核糖體亞基結(jié)合，從而起到自身保護作用?，F(xiàn)已確定16S rRNA的2個位點的甲基化導(dǎo)致2種不同的氨基糖苷類抗生素耐藥表型。其中一類16S rRNA甲基化酶對A1408進行甲基化，另一類則對G1405甲基化。前一類對卡那霉素和安普霉素產(chǎn)生耐藥性，但對慶大霉素敏感，后一類對卡那霉素和慶大霉素耐藥，對安普霉素敏感。這2個核苷酸均位于16S rRNA的A位區(qū)域，而氨基糖苷類抗生素正是通過結(jié)合這一位點阻礙肽酰-tRNA由A位移位至P位點，從而干擾蛋白正確翻譯。

3.2 50S核糖體亞基

50S核糖體抑制劑包括大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類、鏈陽性菌素、氨酰醇以及唑烷酮。50S核糖體抑制劑通過物理性阻礙蛋白質(zhì)翻譯起始過程或肽酰tRNA移位過程抑制肽基轉(zhuǎn)移酶延長新合成多肽鏈的反應(yīng)。耐藥機制為3個起始因子、30S小亞基與其P位上攜帶的起始tRNA甲硫氨酸會先于50S核糖體結(jié)合在mRNA上。正常情況下，由于唑烷酮類抗生素占據(jù)50S核糖體的P位點，50S核糖體因此不能與30S核糖體結(jié)合生成70S成熟核糖體，翻譯起始過程被終止。若50S已與30S核糖體生成成熟核糖體，則唑烷酮占據(jù)50S核糖體P位點可導(dǎo)致A位上氨基酸-tRNA無法轉(zhuǎn)移至P位，翻譯過程終止。

50S核糖體突變多為23S rRNA 2 576位的G突變?yōu)閁，這一結(jié)構(gòu)位于P位點附近。因此可以確定P位點結(jié)構(gòu)突變導(dǎo)致唑烷酮無法再發(fā)揮藥效。2 032和2 447位的突變則與降低唑烷酮與核糖體結(jié)合有關(guān)[43]。

大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類抗生素和鏈陽性菌素B的耐藥性，也就是所謂的MLSB耐藥性表型是由核糖體甲基化引起的。MLSB表型的erm基因編碼紅霉素核糖體甲基化酶，從而使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。在致病菌中，erm蛋白對新生成23S rRNA的單個腺嘌呤進行雙甲基化。而位于23S rRNA保守區(qū)域的A2058（腺嘌呤）卻對以上3種抗生素結(jié)合起重要作用。由于甲基化作用，抗生素與靶點的結(jié)合被阻礙。大量對大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥性的微生物，包括革蘭陽性菌、螺旋體以及厭氧菌均表達(dá)erm甲基化酶。

至今已有將近40種erm基因被報道。在致病菌中，其多數(shù)來源于可自轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子中。4類erm基因包括：erm(A)、erm(B)、erm(C)和erm(F)。erm(A)和erm(C)存在于金黃色葡萄球菌中，erm(B)大多分布于鏈球菌和腸球菌，erm(F)則分布于擬桿菌及其他厭氧菌中[44]。

4 相關(guān)藥物研究

參考湯森路透Intergrity數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)，總結(jié)了目前具有抗多藥耐藥作用的藥物及活性化合物的研究現(xiàn)狀（見表1）。

表1 具有抗耐藥微生物或腫瘤活性的在研藥物Table 1 New drugs in development with activity against resistant microorganisms or tumors

續(xù)表1

5 結(jié)語

臨床上的多藥耐藥性問題日趨凸顯。通過總結(jié)多藥耐藥相關(guān)靶點信息和活性化合物的研究狀況不難發(fā)現(xiàn)，新型的抗多藥耐藥藥物的開發(fā)面臨著一些困難和挑戰(zhàn)，例如，多藥耐藥的機制相對復(fù)雜，編碼相關(guān)蛋白的基因的突變存在多樣性和易變性，還有待深入研究；目前新發(fā)現(xiàn)的活性化合物普遍存在溶解性和透膜性較差等問題，需進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化?？傊?，抗多藥耐藥藥物的研發(fā)工作任重而道遠(yuǎn)。針對目前腫瘤和細(xì)菌多藥耐藥的現(xiàn)狀，我們建議從以下角度來進行相關(guān)藥物的研發(fā)：第一，開發(fā)新靶點新機制的藥物，新的靶點和機制對于解決目前的耐藥情況可能是一條便捷、有前景的道路；第二，開發(fā)多靶點的藥物，多靶點藥物可以增強當(dāng)前使用的藥物的治療效果，緩解耐藥性；第三，藥物的開發(fā)應(yīng)綜合考慮藥物代謝動力學(xué)性質(zhì)，以增加臨床成功率。

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Research Progress in Therapeutic Targets for Multidrug Resistance and Related Drugs

WU Chen, XU Zhuxuan, ZHOU Qimeng, ZHI Yunbao, LIN Kejiang
( Department of Pharmacy, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China)

Multidrug resistance (MDR) refers to the process in which cells produce wide resistance to a variety of drugs, leading to unsatisfied treatment. Multidrug resistance mainly occurs in treatment of infections and cancers, which greatly restricts the therapeutic effects on both diseases. The research progress of anti-MDR mechanisms and drugs based on the receptor types, including transport proteins, ion channels, enzymes and ribosomes, has been reviewed in this paper, so as to provide references for the development of anti-MDR drugs.

multidrug resistance; infection; tumor; transporter; enzyme; ribosome protein

R966

A

1001-5094（2014）11-0829-12

接受日期：2014-09-22

*通訊作者：林克江，副教授；

研究方向：新藥設(shè)計；

Tel：025-83271351； E-mail：link@cpu.edu.cn