介孔二氧化硅納米材料的皮膚安全性研究

陳日來，李玉珍，李衡梅，劉新宇，李 成，李紅俠（.深圳市福田區(qū)第二人民醫(yī)院，廣東 深圳 58049；.廣東醫(yī)學(xué)院附屬福田醫(yī)院，廣東深圳 58033）

介孔二氧化硅納米材料（Mesoporous silica nanomaterials，MSNs）是一種新型無機(jī)納米材料，因其具有無序網(wǎng)狀含孔結(jié)構(gòu)、孔徑分布窄且可調(diào)節(jié)、比表面積巨大、可表面化學(xué)修飾等特性[1-3]，被廣泛應(yīng)用于催化、吸附、材料及藥物載體等領(lǐng)域的研究[4-7]。隨著MSNs的規(guī)?；a(chǎn)及其產(chǎn)品的普及，導(dǎo)致其與人體直接接觸的機(jī)會(huì)日益增加。皮膚作為外源性物質(zhì)的主要靶組織[8]，MSNs有可能透過皮膚進(jìn)入機(jī)體，在生物體內(nèi)產(chǎn)生一定的生物學(xué)效應(yīng)，因此有必要對(duì)其皮膚安全性進(jìn)行研究。本文選擇了目前研究最為廣泛的MSNs和氨基修飾的MSNs（NH2-MSNs），基于其凝膠的施藥形式，通過在體皮膚滲透實(shí)驗(yàn)、刺激性實(shí)驗(yàn)和過敏性實(shí)驗(yàn)，對(duì)MSNs的外用安全性進(jìn)行考察，為其進(jìn)一步研究和開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

ICPE-9000型電感耦合等離子發(fā)射光譜儀（日本島津公司）；Hitachi-7500透射電子顯微鏡（日本日立公司）；BS 323S分析天平（德國(guó)Sartorius公司）。

1.2 藥品與試劑

MSNs和NH2-MSNs（中南大學(xué)材料學(xué)院，白色固體狀粉末，粒徑：200～300 nm，孔徑：3～10 nm）；1，2-丙二醇（長(zhǎng)沙分路口塑料化工廠，分析純）；2，4-二硝基氯代苯（DNCB，美國(guó)Sigma公司，純度：98.8%）；脫水山梨醇單油酸酯（司盤80，湖南爾康制藥有限公司）；聚氧乙烯硬脂酸酯（Myrj 52）、卡波姆934（德國(guó)BASF公司）；其余試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

2 方法與結(jié)果

2.1 凝膠的制備

稱取卡波姆934約0.5 g，研磨后先加入少量純化水潤(rùn)濕，再補(bǔ)足至22.65 ml，攪拌均勻后，靜置過夜，使充分溶脹，用三乙醇胺調(diào)節(jié)pH至7.4，得凝膠基質(zhì)。稱取MSNs、NH2-MSNs各0.75 g，分別加入1，2-丙二醇22.5 g，高速剪切5 min（1 000×g），探頭超聲3 min，得MSNs/丙二醇分散液、NH2-MSNs/丙二醇分散液。稱取司盤80、聚氧乙烯硬脂酸酯各1.5 g、液體石蠟7.25 g，依次加入到MSNs/丙二醇分散液、NH2-MSNs/丙二醇分散液中，60 ℃水浴熱溶攪勻，即油相。在磁力攪拌下（900 r/min），往油相中緩慢加入純化水32.50 ml，60 ℃水浴攪拌30 min后，停止加熱，得初乳。當(dāng)溫度降為50 ℃時(shí)，將乳液以細(xì)流狀加入到凝膠基質(zhì)中，恒速攪勻、放冷，即分別制得載0.75%MSNs或NH2-MSNs的凝膠。同法操作，分別制備載3%（最大載材料量）MSNs或NH2-MSNs的凝膠、空白凝膠（不含MSNs或NH2-MSNs），待用。

2.2 皮膚中硅含量的測(cè)定方法

2.2.1 檢測(cè)條件。電感耦合等離子發(fā)射光譜儀優(yōu)化參數(shù)：射頻（RF）功率1 300 W，霧化器流量0.8 L/min，輔助氣流量1.0 L/min，等離子氣流量15 L/min，霧化氣壓力220 kPa，一次讀數(shù)時(shí)間10 s，進(jìn)樣延時(shí)20 s，泵速15 r/min，分析譜線251.611 nm。

2.2.2 樣品前處理。取涂布區(qū)皮膚（0.25 cm×0.25 cm），用濾紙吸干皮膚表面的凝膠，丙二醇沖洗皮膚表面5次，每次3 ml，清洗后再用濾紙吸干。精密稱取皮膚樣品0.4 g，置于耐高溫微波消解罐中，加入5 ml硝酸和2 ml氫氟酸，室溫下靜置預(yù)消解30～40 min，再將紅外掃描異常監(jiān)控系統(tǒng)的溫度設(shè)為200 ℃，分3個(gè)階段（20～180、180～200、200～220 ℃）進(jìn)行消毒，每個(gè)階段6 min。消解完畢后，趁熱打開罐蓋加入4%硼酸2 ml，迅速蓋緊，待冷至室溫后，放置于通風(fēng)櫥內(nèi)靜置抽風(fēng)，至清澈后轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，加少許去離子水洗滌消解罐與罐蓋3～4次，再定容至10 ml，渦旋混勻，按“2.2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定皮膚中硅含量（μg/g）。

2.2.3 方法學(xué)考察。將參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)配制的5%稀硝酸硅標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μg/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定其中硅含量，得硝酸硅標(biāo)準(zhǔn)溶液中硅峰面積（y）對(duì)質(zhì)量濃度（x）的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y＝789.635x－21.328（r2＝0.999 9）。在該檢測(cè)條件下，定量限、精密度及回收率結(jié)果均符合生物樣本分析的一般要求[9]。

2.3 在體透皮實(shí)驗(yàn)

取豚鼠20只，隨機(jī)分為5組，即空白凝膠組、0.75%MSNs凝 膠 組、0.75%NH2-MSNs凝膠組、3%MSNs凝 膠組、3%NH2-MSNs凝膠組，每組4只，實(shí)驗(yàn)過程中豚鼠自由飲食飲水。給藥前24 h將豚鼠背部皮膚去毛（3 cm×3 cm），取受試物0.5 g涂布于去毛區(qū)，然后以兩層2.5 cm×2.5 cm的紗布和一層玻璃紙覆蓋，再用無刺激性膠布和繃帶加以固定。24 h后，觀察各組豚鼠的外觀體征和行為活動(dòng)情況，然后經(jīng)麻醉后處死，取涂布區(qū)皮膚（約0.5 cm×0.5 cm），修剪成若干0.1 cm×0.1 cm的小塊，稱質(zhì)量，測(cè)定皮膚中硅含量，結(jié)果見表1。

表1 在體透皮實(shí)驗(yàn)結(jié)果（，n＝4）Tab 1 Results ofin vivo permeation tests（，n＝4）

表1 在體透皮實(shí)驗(yàn)結(jié)果（，n＝4）Tab 1 Results ofin vivo permeation tests（，n＝4）

與空白凝膠組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.blank gel group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

給藥24 h后，各組豚鼠的外觀體征、行為活動(dòng)均正常，未見任何中毒癥狀。由表1可知，與空白凝膠組比較，其余各組豚鼠皮膚中硅含量均增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05或P＜0.01），提示MSNs可透過皮膚表層，進(jìn)入皮膚深層。

2.4 皮膚組織超顯微結(jié)構(gòu)考察

取“2.3”項(xiàng)下0.75%MSNs凝膠組、0.75%NH2-MSNs凝膠組、3%MSNs凝膠組、3%NH2-MSNs凝膠組豚鼠的皮膚組織，作超薄切片處理[蘇木精-伊紅（HE）染色]，透射電鏡觀察MSNs在皮膚中的分布情況。鏡檢結(jié)果顯示，皮膚角質(zhì)層細(xì)胞中含有MSNs，主要分布在細(xì)胞內(nèi)涵體和細(xì)胞質(zhì)中，此外真皮層皮膚也有少量分布，并轉(zhuǎn)移至血管腔中，提示MSNs能夠透過皮膚屏障，穿透血管壁，進(jìn)入體循環(huán)。透射電鏡圖詳見圖1。

圖1 各組皮膚的透射電鏡圖（HE，×40 000）A.0.75%MSNs凝膠組；B.0.75%NH2-MSNs凝膠組；C.0.3%MSNs凝膠組；D.0.3%NH2-MSNs凝膠組Fig 1 Transmission electron micrograph of skin（HE，×40 000）A.0.75% MSNs gel group；B.0.75% NH2-MSNs gel group；C.0.3%MSNs gel group；D.0.3%NH2-MSNs gel group

2.5 皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)

取家兔8只，隨機(jī)分為完整皮膚組和破損皮膚組，每組4只，采用同體左右側(cè)自身對(duì)照設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。給藥前24 h于家兔脊柱兩側(cè)備4塊去毛區(qū)，完整皮膚組受試部位皮膚需完好、無損傷；破損皮膚組受試部位用75%酒精消毒后，用無菌針頭劃“井”字，以刺傷表皮不傷真皮、輕度滲血為度，且左右兩側(cè)皮膚的破損程度應(yīng)基本一致。為了考察接觸MSNs后皮膚的反應(yīng)嚴(yán)重程度，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇3%MSNs凝膠和3%NH2-MSNs凝膠進(jìn)行研究。給藥方案：兩組家兔背部左側(cè)皮膚上、下區(qū)分別均勻涂布3%MSNs凝膠和3%NH2-MSNs凝膠各0.5 g，右側(cè)皮膚上、下區(qū)分別涂布空白凝膠0.5 g和生理氯化鈉溶液0.5 ml，涂抹后均用兩層3 cm×3 cm的紗布和一層玻璃紙覆蓋，再用無刺激性膠布和繃帶加以固定，敷貼4 h。然后除去包裹物，用溫水清洗涂布部位。每日在同一部位給藥，每次敷貼時(shí)間相同，連續(xù)7 d。從第2天開始，每次涂布前剃毛，用溫水洗去殘留凝膠，1 h后以及再次涂抹前分別觀察及記錄每只家兔有無紅斑、水腫；涂抹區(qū)有無色素沉著等現(xiàn)象，并對(duì)紅斑及水腫情況按《皮膚刺激性反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)》[10]進(jìn)行評(píng)分。末次涂布去除凝膠后1、24、48、72 h肉眼觀察，記錄涂布區(qū)有無紅斑和水腫等現(xiàn)象。結(jié)果顯示，給予3%MSNs凝膠、3%NH2-MSNs凝膠處理過的完整皮膚組、破損皮膚組在每次去除藥物后1 h及再次涂布前，末次涂布去除凝膠后1、24、48、72 h，皮膚表面均未見有紅斑、水腫、糜爛、壞死等現(xiàn)象，刺激性評(píng)分均為0。與空白凝膠和生理氯化鈉溶液比較，3%MSNs和3%NH2-MSNs凝膠對(duì)家兔皮膚刺激性差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)對(duì)家兔完整皮膚和破損皮膚的組織形態(tài)進(jìn)行病理學(xué)檢查，亦均未見有明顯的毒性損傷作用，皮膚表皮完整，未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、水皰、潰瘍等病變，真皮未見充血。結(jié)果表明，MSNs對(duì)皮膚無刺激性反應(yīng)。

2.6 皮膚過敏性實(shí)驗(yàn)

表2 皮膚致敏性實(shí)驗(yàn)中各組豚鼠的體質(zhì)量變化（，n＝6）Tab 2 The change of body weight of guinea pig in skin irritation tests（，n＝6）

表2 皮膚致敏性實(shí)驗(yàn)中各組豚鼠的體質(zhì)量變化（，n＝6）Tab 2 The change of body weight of guinea pig in skin irritation tests（，n＝6）

激發(fā)結(jié)果顯示，空白凝膠組豚鼠激發(fā)接觸后6～72 h涂布區(qū)均未出現(xiàn)紅斑、水腫等過敏反應(yīng)，致敏率為0，即無致敏性。陽(yáng)性對(duì)照組豚鼠激發(fā)接觸后6 h開始，均出現(xiàn)不同程度的紅斑和水腫，6、24、48、72 h的致敏率分別為100%、100%、50%、16.7%，皮膚致敏性評(píng)價(jià)分別為極度致敏性、極度致敏性、中度致敏性、輕度致敏性。3%MSNs凝膠組、3%NH2-MSNs凝膠組豚鼠激發(fā)接觸后6～72 h均未出現(xiàn)紅斑及水腫，致敏率為0，即無致敏性。結(jié)果表明，MSNs對(duì)皮膚無致敏反應(yīng)。

3 討論

3.1 樣品測(cè)定方法的選擇

隨著世界上硅學(xué)研究不斷興起，硅含量測(cè)定的方法也在不斷更新，常規(guī)方法有重量法、鉬藍(lán)比色法等[12-13]，但此類方法操作比較煩瑣、費(fèi)時(shí)，且大樣本量的分析操作難度大，在一定程度上限制了硅學(xué)研究的進(jìn)一步擴(kuò)展。本研究采用電感耦合等離子發(fā)射光譜法測(cè)定皮膚中硅元素的含量，以硅元素的含量來定量反映MSNs的透皮特征，方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速，大大縮短了分析時(shí)間，提高了效率。

3.2 MSNs的透皮行為

在體透皮實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，載MSNs凝膠在皮膚中的硅含量顯著高于空白凝膠組（P＜0.05），提示MSNs可跨越皮膚屏障，進(jìn)入皮膚深層。鏡檢顯示，大鼠局部皮膚染毒后，MSNs在角質(zhì)層細(xì)胞、真皮層細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)涵體中都有分布，而且能進(jìn)入血管，這與文獻(xiàn)報(bào)道的MSNs能夠透過皮膚并進(jìn)入體循環(huán)相[14]一致。

3.3 MSNs的皮膚刺激性及過敏性

本研究采用家兔和豚鼠為受試動(dòng)物，進(jìn)行多次給藥皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)和皮膚過敏實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均未顯示任何陽(yáng)性反應(yīng)。提示MSNs對(duì)皮膚的安全性良好，結(jié)合其特殊的理化性質(zhì)（載藥量大、可控釋藥），MSNs可用于局部施藥載體的研究。

3.4 致敏試劑的選擇

皮膚作為外源性化學(xué)物質(zhì)侵入機(jī)體的第一道天然屏障，化學(xué)物質(zhì)附著于皮膚表面后通常會(huì)導(dǎo)致接觸性皮炎的產(chǎn)生，因此，在評(píng)價(jià)皮膚致敏試驗(yàn)中，化學(xué)物是重要的致敏原。DNCB作為目前最常用的一種化學(xué)致敏物，已得到廣泛應(yīng)用，其致敏機(jī)制是激活與致敏炎癥的發(fā)生密切相關(guān)的皮膚內(nèi)源性蛋白CD86分子的高表達(dá)，從而引起特異T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生紅斑、水腫等過敏反應(yīng)。

綜上所述，MSNs對(duì)家兔完整皮膚和破損皮膚均未見有明顯的毒性刺激性損傷作用，對(duì)豚鼠致敏接觸后無致敏作用，提示MSNs及NH2-MSNs是一種安全性良好的無機(jī)納米材料。本研究結(jié)果將為MSNs作為施藥載體用于外用制劑研究提供科學(xué)依據(jù)。

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