大孔樹脂純化丹參總酚酸的研究

趙萱，傅超美，徐曉秋

·炮制制劑·

大孔樹脂純化丹參總酚酸的研究

趙萱，傅超美，徐曉秋

目的：確立大孔樹脂純化丹參總酚酸的最佳純化工藝。方法：以靜態(tài)吸附率和解吸率為考察指標(biāo)，確定大孔樹脂型號(hào)，并確定純化工藝參數(shù)。結(jié)果：選擇HPD-400型號(hào)大孔樹脂用于丹參總酚酸的純化工藝，最佳吸附工藝條件為：上樣吸附流速為2BV/h，上柱液的濃度為0.5 g生藥/mL，pH值為4；解析前，以3BV的水洗脫除雜，最佳解析工藝條件為：選擇乙醇為洗脫劑，洗脫劑濃度為40%，pH值為5，控制解析流速為3BV/h。結(jié)論：所建立的方法簡便、準(zhǔn)確，可用于丹參總酚酸的純化。

丹參總酚酸；大孔樹脂；純化工藝

大孔吸附樹脂是一類有機(jī)高聚物吸附劑。大孔吸附樹脂具有比表面積較大、交換速度較快、吸附量大、解吸和再生容易等優(yōu)點(diǎn)，近幾年在天然產(chǎn)物的分離純化中被廣泛應(yīng)用，本文采用大孔吸附樹脂進(jìn)行分離提純處理，并對(duì)分離提純條件進(jìn)行了詳細(xì)的研究。

1 材料

中江丹參(產(chǎn)地：四川中江，經(jīng)鑒定符合《中國藥典》2010年版一部53頁“丹參”項(xiàng)下相關(guān)要求，購于成都西南藥都藥材市場)，原兒茶醛對(duì)照品(中國藥品生物制品檢驗(yàn)所，批號(hào)810-200004)。HPD-100，HPD-200A，HPD-400，HPD-500，HPD-700樹脂(河北滄州寶恩化工有限公司)，鹽酸，乙醇，甲醇，十二烷基磺酸鈉，鐵氰化鉀，三氯化鐵等試劑試藥均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液制備

取丹參藥材2500g，浸泡30分鐘，10倍量水，提取2次，每次提取1.5h，第一次加水時(shí)補(bǔ)足吸水率200%，提取液濾過，濾液濃縮至1 g生藥/mL，靜置過夜，濾過，濾液作為上樣液。

測(cè)定丹參總酚酸含量及溶液的總體積，相關(guān)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見下表1。

表1 上樣液制備相關(guān)數(shù)據(jù)表

2.2 大孔樹脂型號(hào)的篩選[4]

選用滄州寶恩公司HPD系列大孔吸附樹脂進(jìn)行試驗(yàn)，以樹脂靜態(tài)吸附量、解吸率等為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)樹脂型號(hào)進(jìn)行篩選。

（1）樹脂靜態(tài)吸附量的考察

稱取經(jīng)預(yù)處理后的7種大孔樹脂5g（以干樹脂計(jì)）至250mL錐形瓶中，分別加入上樣液50mL，靜置24小時(shí)，濾過，以原兒茶醛為對(duì)照品，用紫外分光光度法測(cè)定濾液中丹參總酚酸的含量，計(jì)算各干樹脂的靜態(tài)吸附容量和吸附率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 各型號(hào)大孔樹脂的吸附容量

由以上靜態(tài)吸附容量實(shí)驗(yàn)可見，中等極性的HPD-400樹脂以及極性樹脂HPD-500、HPD-600的吸附容量效果明顯優(yōu)于其他樹脂，與丹參酚酸類物質(zhì)含酚羥基屬中等極性化合物的性質(zhì)一致，因而選取這三種樹脂，進(jìn)一步考察其解吸率。

（2）樹脂解吸率的考察

將上述吸附飽和的大孔吸附樹脂，用水洗至水洗液無色，去除樹脂表面殘留的溶液，各樹脂分別依次用30%、50%、60%、70%、90%乙醇浸泡洗脫2次，每次10 mL、每次浸泡2h、每1h超聲振搖5min。收集各不同乙醇濃度的洗脫液。以原兒茶醛為對(duì)照品，用紫外分光光度法測(cè)定各洗脫液中丹參總酚酸剩余量和解吸量，計(jì)算解吸率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 三種HPD樹脂的吸附與解吸情況

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HPD-400大孔樹脂與其余兩種樹脂相比，具有較高的的吸附量與良好的解吸率，故選擇HPD-400型號(hào)大孔樹脂用于丹參總酚酸的純化工藝研究。

2.3 大孔樹脂吸附條件的篩選

以吸附流速、上柱液濃度、上柱液酸堿度三個(gè)方面對(duì)樹脂吸附曲線的影響，確定大孔樹脂吸附純化工藝的最佳參數(shù)。

（1）上樣液濃度對(duì)樹脂吸附量的影響

取丹參靜置濾過除雜后的提取液，調(diào)節(jié)濃度分別為0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3、1.5 g生藥/mL，取各濃度丹參上樣液50mL，加入預(yù)處理好的HPD-400大孔樹脂5mL，靜態(tài)吸附過夜，吸附完成后分離出上清液，以原兒茶醛為對(duì)照品，用紫外分光光度法測(cè)定剩余上清液中丹參總酚酸含量。結(jié)果見表4。

表4 上樣液濃度對(duì)樹脂吸附量的影響

結(jié)果表明，當(dāng)上樣液濃度在0.5～0.7 g生藥/mL時(shí)，大孔樹脂對(duì)丹參總酚酸的吸附率較高，考慮生產(chǎn)成本與便于控制，確定上樣液濃度為0.5 g生藥/mL。

（2）上樣液pH值對(duì)樹脂吸附量的影響

取濃度為0.5 g生藥/mL的上樣液，調(diào)節(jié)pH值分別為2、4、6、8、10，取各pH值的丹參上樣液50mL，加入預(yù)處理好的HPD-400大孔樹脂5mL，靜態(tài)吸附過夜，吸附完成后分離出上清液，以原兒茶醛為對(duì)照品，用紫外分光光度法測(cè)定剩余上清液中丹參總酚酸含量。結(jié)果見表5。

表5 上樣液pH值對(duì)樹脂吸附量的影響

結(jié)果表明，上柱液pH值為4時(shí)，樹脂的吸附效果最佳，且符合該型號(hào)大孔樹脂使用的pH值范圍，故確定上柱液的pH值為4。

（3）吸附流速的考察

選用3根同樣的樹脂柱，量取5mL樹脂，濕法裝柱，徑高比約1: 6。取丹參上柱液（濃度0.5 g生藥/ mL，pH=4），提取液通過樹脂柱的流速分別為1BV/ h，2 BV/h，3 BV/h，室溫。分批收集流出液，每流出2BV，即2倍樹脂體積收集一份。以原兒茶醛為對(duì)照品，用紫外分光光度法測(cè)定每份流出液中丹參總酚酸的含量，計(jì)算每份流出液中丹參總酚酸的泄漏率，并對(duì)流出液的標(biāo)號(hào)作樹脂動(dòng)態(tài)曲線。當(dāng)流出液中丹參總酚酸的泄漏率為10%時(shí)，計(jì)算此時(shí)樹脂的吸附量。

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合生產(chǎn)效率，確定上樣流速為2BV/h。

2.4 大孔樹脂洗脫條件的篩選

（1）洗脫溶劑的選擇與洗脫劑用量的確定

本實(shí)驗(yàn)選用乙醇作為洗脫劑，并對(duì)乙醇濃度進(jìn)行考察。

選用3根同樣的樹脂柱，量取5mL樹脂，濕法裝柱，徑高比約1:6。取丹參上柱液（濃度0.5 g生藥/mL，pH=4）以2 BV/h的流速上柱，動(dòng)態(tài)吸附飽和后，分別依次用水和乙醇洗脫，控制洗脫流速為3BV/h，室溫條件下，水洗液每1BV收集一份，共收集6份，測(cè)定每份水洗脫液的總固體量，以編號(hào)為橫坐標(biāo)繪制水洗脫雜質(zhì)曲線。乙醇洗脫液每1BV收集一份，共收集6份，測(cè)定每份中洗脫液丹參總酚酸的量,以每份洗下的總酚酸量為縱坐標(biāo)，以編號(hào)為橫坐標(biāo)繪制洗脫曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6、表7。

表6 水洗脫液的總固體量

由水洗脫曲線可知，水用量為3BV時(shí)，基本達(dá)到最大雜質(zhì)洗脫量，確定水洗脫量為3BV。

選用3根同樣的樹脂柱，量取5mL樹脂，濕法裝柱，徑高比約1: 6。取丹參上柱液（濃度0.5 g生藥/ mL，pH=4）以2 BV/h的流速上柱，動(dòng)態(tài)吸附飽和后，用乙醇洗脫，控制洗脫流速為3BV/h，室溫條件下，洗脫液每1BV收集一份，共收集6份，測(cè)定每份中洗脫液丹參總酚酸的量，以每份洗下的總酚酸量為縱坐標(biāo)，以編號(hào)為橫坐標(biāo)繪制洗脫曲線。

表7 丹參總酚酸的乙醇洗脫量

由丹參總酚酸的乙醇洗脫曲線可知，乙醇用量為4BV時(shí)，基本達(dá)到最大丹參總酚酸洗脫量。三種不同濃度的乙醇洗脫效果，以40%較好。故最終確定洗脫溶劑為40%乙醇，洗脫劑用量為4BV。

（2）洗脫劑pH值的確定

取4份己知吸附量的飽和吸附濕樹脂各5 mL，分別加入pH=4, 5, 6, 7的40%的乙醇各20mL，超聲振蕩10min后再室溫靜置12h，測(cè)定解析液中丹參總酚酸的含量，計(jì)算解析率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表13。

表8 洗脫劑pH值對(duì)樹脂靜態(tài)解析的影響

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，最終確定洗脫劑pH值為5，即洗脫溶劑為pH=5的40%乙醇。

（3）洗脫流速的確定

選用3根同樣的樹脂柱，量取5 mL樹脂，濕法裝柱，徑高比約1: 6。取丹參上柱液（濃度0.5g生藥/mL，pH=4）以2 BV/h的流速上柱，動(dòng)態(tài)吸附飽和后，3BV的水以3BV/h的流速洗脫，水洗脫雜質(zhì)后，以4BV 的pH=5的40%乙醇為洗脫劑，控制洗脫劑通過樹脂柱流速分別為3BV/h、4BV/h、5BV/h，室溫條件下，洗脫液每0.5 BV收集一份，測(cè)定每份洗脫液中丹參總酚酸含量，繪制樹脂動(dòng)態(tài)解析曲線，比較洗脫效果，選擇最佳洗脫流速。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表9。

表9 不同流速下丹參總酚酸的乙醇洗脫效果

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，流速為3BV/h時(shí)總洗脫率最高，綜合考慮解析曲線的峰值、收斂性及生產(chǎn)效率，確定3BV/h流速為最佳洗脫流速。

綜合以上研究，最終確定大孔樹脂純化丹參總酚酸的工藝參數(shù)為：選擇HPD-400型號(hào)大孔樹脂用于丹參總酚酸的純化工藝，最佳吸附工藝條件為：上樣吸附流速為2BV/h，上柱液的濃度為0.5 g生藥/ mL，pH值為4；解析前，以3BV的水洗脫除雜，最佳解析工藝條件為：選擇乙醇為洗脫劑，洗脫劑濃度為40%，pH值為5，控制解析流速為3BV/h，以上吸附和解析均在室溫下進(jìn)行。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

按確定的上述工藝條件，做3次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果見表10。

表10 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

由以上重復(fù)性實(shí)驗(yàn)可知，該大孔樹脂的除雜工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

3.1 實(shí)驗(yàn)中常用水提法提取丹參中總酚酸，水提取液中雜質(zhì)較多，如無機(jī)鹽、蛋白質(zhì)、糖、鞣質(zhì)等，使得到的水提取液中丹參總酚酸的濃度較低。為了提高提取液中酚酸類物質(zhì)的濃度，常采用醇提水沉淀法、吸附澄清法、高速離心法、超濾法等方法進(jìn)行分離純化處理。但這些操作往往具有有效成份損失較高、生產(chǎn)周期長、分離處理成本高等缺點(diǎn)。大孔吸附樹脂具有吸附量大、解吸和再生容易等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于中藥行業(yè)中，本文試驗(yàn)結(jié)果表明，其可用于丹參總酚酸的分離純化。

3.2 樹脂洗脫試驗(yàn)中，常用的洗脫劑有乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯等，為減少對(duì)產(chǎn)品刺激性的影響及保護(hù)環(huán)境，本實(shí)驗(yàn)選用乙醇作為洗脫劑，丹參總酚酸主要集中在30%乙醇洗脫液中，50%洗脫液中雖然有一定量，但總酚酸的含量明顯偏低，而70%～90%洗脫液中幾乎不含丹參總酚酸，由此可預(yù)測(cè)，乙醇的洗脫濃度范圍應(yīng)在30%～50%范圍內(nèi)，進(jìn)而采用動(dòng)態(tài)洗脫方法，確定了乙醇的最佳濃度。

[1] 李廣勝,王光新,趙牛和.丹參口服液中總酚酸性成分的含量測(cè)定[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2001,12(8):683.

[2] 曹冬,黃喜茹等.丹參及丹參制劑中水溶性酚酸總量的測(cè)定[J].世界科學(xué)技術(shù)——中醫(yī)藥現(xiàn)代化.中藥制劑研究,2005,7 (4):67.

[3] 李廣勝,王光新,趙牛和.丹參口服液中總酚酸性成分的含量測(cè)定[J].時(shí)針國醫(yī)國藥,2001,12(8):683.

[4] 袁海龍,李仙義,等.D-101型大孔樹脂殘留物的頂空進(jìn)樣法分析研究[J].中藥新藥與臨床藥理,2003,14(2):121.

（責(zé)任編輯:胡慧玲）

Purifcation of Total phenolic acid of Danshen by macroporous resin

Objective:To establish the purification technology of Total phenolic acid of Danshen by macroporous resin. Method: Static adsorption rate and desorption rate were taken as indexs to optimize the type of macroporous resin and purifcation technology parameters. Result: The HPD-400 macroporous resin was chosen in the purifcation technology of Total phenolic acid of Danshen. Optimum adsorption technological conditions were as following: The adsorption rate was 2BV/h. The concentration was 0.5 g raw drug/mL with pH of 4. 3BV water was used to elute impurity before desorption. Optimum desorption technological conditions were as following: Eluted with 40% ethanol aqueous at the fow rate 3BV/h, and pH was 5. Conclusion: The method is simple，accurate，specifc and can be applied in the purifcation of Total phenolic acid of Danshen.

Total phenolic acid of Danshen; macroporous resin; purifcation technology

R 283.6

A

1674-926X(2014)01-005-04

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137

趙萱（1986-），女，四川德陽，碩士研究生，助教，研究方向：中藥新制劑和新劑型的研究Email:626098860@qq.com

傅超美（1961-），男，四川簡陽，教授，博導(dǎo)，研究方向：中藥新制劑和新劑型的研究Email:chaomeifu@126.com

2013-10-22

ZHAO Xuan, FU Chao-mei, XU Xiao-qiu//(Pharmacy College,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine;The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine;State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, China)