地諾孕素對異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制研究＊

劉曉娟，張玉虹，王 虹

（河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北張家口075000）

子宮內(nèi)膜異位癥以子宮內(nèi)膜組織的異位生長及相關(guān)的盆腔疼痛、痛經(jīng)、和不孕不育為特點(diǎn)[1]，在育齡婦女中有約10%的發(fā)病率，近年來發(fā)病率明顯呈上升趨勢[2]。雖然關(guān)于子宮內(nèi)膜異位癥的基礎(chǔ)研究和臨床研究取得了一定進(jìn)展，但仍不明確其誘因和發(fā)病機(jī)制?，F(xiàn)階段臨床治療方法主要是藥物或手術(shù)，由于患者多為育齡女性，手術(shù)治療有局限性；而藥物治療存在停藥復(fù)發(fā)[3]、干擾凝血和脂代謝等不良反應(yīng)多的問題[4]。故而探究子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制并尋找到有效的治療方案，會給患者帶來福音。地諾孕素是選擇性黃體激素類藥物，2010年它與雌二醇復(fù)方作為避孕藥在美國上市。有研究表明，地諾孕素具有緩解子宮內(nèi)膜異位癥疼痛、穩(wěn)定子宮內(nèi)膜組織的作用[5-8]。其作用效果相當(dāng)于醋酸亮丙瑞林，但地諾孕素具有更好的耐受性，且不良反應(yīng)率低。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)體外培養(yǎng)異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞，研究地諾孕素對子宮內(nèi)膜異位癥的治療作用及其潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 地諾孕素（Bayer公司），胎牛血清（FBS，Gibco公司），DMEM（Hyclone公司），膠原酶（Invitrogen公司），細(xì)胞360目濾網(wǎng)（上海通善生物科技有限公司），鼠抗波形蛋白抗體（武漢博士德公司），SABC試劑盒（武漢博士德公司），噻唑藍(lán)（MTT，Sigma公司），二甲亞砜（DMSO，Sigma公司），碘化丙啶（PI，Sigma公司），抗體：β-actin（Human，Origene公司）、NF-κB（Human，Origene公司）、Bcl-2（Santa Cruz公司）和 Bcl-XL（Santa Cruz公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 原代細(xì)胞來源于2013年6～12月，院中婦產(chǎn)科收治的術(shù)前無激素類藥物服用史的卵巢巧克力囊腫患者。取患者異位子宮內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜組織，進(jìn)行離體培養(yǎng)。將組織剪碎并用含有雙抗的D-Hanks液漂洗，加入4倍組織體積的膠原酶37℃消化1h，懸濁液過360目細(xì)胞濾網(wǎng)。濾液1 000r／m離心10min后，棄上清液用DMEM重懸，用含有20%FBS的DMEM培養(yǎng)基于37℃、80%相對濕度和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞鑒定 原代細(xì)胞胰酶消化后，加到含有蓋玻片的6孔板中，細(xì)胞貼壁長滿后加入4%多聚甲醛固定。用鼠抗波形蛋白抗體和SABC試劑盒做細(xì)胞免疫熒光檢測。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 NSCS組：正常子宮內(nèi)膜組織的原代細(xì)胞；NSCS-DNG組：用50nmol／L地諾孕素作用NSCS細(xì)胞；ECSC組：異位子宮內(nèi)膜組織的原代細(xì)胞；ECSC-DNG組：用50 nmol／L地諾孕素作用ECSC細(xì)胞。

1.2.4 四甲基偶氮唑鹽比色（MTT）法測定地諾孕素對子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的抑制作用 NSCS細(xì)胞和ECSC細(xì)胞消化后以5×104個(gè)／孔接種于24孔板中，培養(yǎng)過夜后正常地諾孕素組和異位地諾孕素組給予50nmol／L地諾孕素干預(yù)。給藥后在24、48h和72h用MTT法測細(xì)胞增殖。

1.2.5 流式細(xì)胞儀測定地諾孕素對子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞凋亡影響 細(xì)胞傳代于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，24h后正常地諾孕素組和異位地諾孕素組給與50nmol／L地諾孕素干預(yù)。藥物作用48h后收集各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個(gè)／mL，用PI染色法測細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測地諾孕素對子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞NF-κB、Bcl-2和Bcl-XL蛋白表達(dá)的影響 50 nmol／L地諾孕素作用48h后棄去培養(yǎng)基，PBS洗細(xì)胞2次。加入含有PMSF的細(xì)胞裂解液RIPA，刮細(xì)胞，冰上裂解10 min。加入SDS緩沖液，100℃煮沸5min后，冰上冷卻5min后，4℃條件下12 000r／m離心5min，所得上清液用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量。用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。NF-κB、Bcl-2和Bcl-XL一抗工作液4℃孵育過夜后，用NF-κB、Bcl-2和Bcl-XL二抗工作液37℃孵育30min，化學(xué)發(fā)光顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示。組間差異采用t檢驗(yàn)方法，多組差異進(jìn)行單因素方差（one-way ANOVA）分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞鑒定 LEICA倒置熒光顯微鏡鏡檢，原代細(xì)胞培養(yǎng)24h后即可貼壁，細(xì)胞體積較大且多呈梭形。對細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色后，95%以上細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)有綠色熒光。

2.2 地諾孕素對子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的抑制作用 用MTT法檢測地諾孕素對子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞增殖的作用，如圖1所示。NSCS細(xì)胞和ECSC細(xì)胞都表現(xiàn)出隨時(shí)間的增殖趨勢，但ECSC細(xì)胞增殖率低于NSCS細(xì)胞。給予50nmol／L地諾孕素干預(yù)后，NSCS細(xì)胞和ECSC細(xì)胞都表現(xiàn)出了增殖抑制趨勢（P＜0.05），但地諾孕素對ECSC細(xì)胞抑制作用更強(qiáng)（P＜0.05）。

圖1 地諾孕素對子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞增殖的影響

2.3 地諾孕素對子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響 實(shí)驗(yàn)中采用流式細(xì)胞術(shù)對50nmol／L地諾孕素干預(yù)48h各組細(xì)胞進(jìn)行凋亡檢測，檢測結(jié)果顯示：無地諾孕素干預(yù)時(shí)，NSCS細(xì)胞和ECSC細(xì)胞凋亡率低；當(dāng)給予50nmol／L地諾孕素干預(yù)后，NSCS細(xì)胞 凋 亡 率 （6.16±0.54）%，NSCS-DNG 細(xì) 胞 凋 亡 率（43.41±3.77）%，ECSC細(xì)胞凋亡率（5.98±0.66）%，ECSC-DNG細(xì)胞凋亡率（69.57±5.71）%。NSCS細(xì)胞和ECSC細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），而且ECSC細(xì)胞凋亡率高于NSCS細(xì)胞（P＜0.05）。

2.4 地諾孕素對子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞NF-κB、Bcl-2和Bcl-XL蛋白表達(dá)的影響 通過 Western blot法對NSCS組、NSCSDNG組、ECSC組和ECSC-DNG組進(jìn)行 NF-κB、Bcl-2和Bcl-XL蛋白檢測，發(fā)現(xiàn)：各組均有NF-κB、Bcl-2和Bcl-XL蛋白條帶；與NSCS組比較，ECSC組NF-κB、Bcl-2和Bcl-XL蛋白表達(dá)明顯增多，而NSCS-DNG組中NF-κB、Bcl-2和Bcl-XL蛋白表達(dá)減少；與ECSC組比較，ECSC-DNG組中NF-κB、Bcl-2和Bcl-XL蛋白表達(dá)顯著減少。

3 討 論

子宮內(nèi)膜細(xì)胞的程序性凋亡對其保持正常結(jié)構(gòu)和功能具有重要意義，其周期性變化實(shí)際上就是靠月經(jīng)周期的分泌晚期及月經(jīng)期的細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的。而子宮內(nèi)膜異位癥患者的內(nèi)膜細(xì)胞凋亡趨勢減弱，凋亡失去周期性。研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥患者內(nèi)膜較正常內(nèi)膜具有更高的增殖率，且對凋亡調(diào)控不敏感[9]。Bcl-2等抗凋亡基因家族促進(jìn)了子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展[10]，Bcl-2等的大量表達(dá)可以降低子宮內(nèi)膜異位癥內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞對凋亡刺激的敏感性，使其免于被腹腔中的巨噬細(xì)胞吞噬或者以其他方式降解[11]。最終凋亡異常導(dǎo)致異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞在腹腔中的存活能力增強(qiáng)，異位癥發(fā)生、發(fā)展加劇。NF-κB是介導(dǎo)多種細(xì)胞信號通路的關(guān)鍵因子之一，參與機(jī)體免疫應(yīng)答、參與炎性反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)等。王芳等[12]研究發(fā)現(xiàn)，與正常子宮內(nèi)膜組織比較，NF-кB在子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜表達(dá)有增強(qiáng)趨勢，而在異位內(nèi)膜組織表達(dá)增強(qiáng)最顯著（P＜0.05）。對子宮內(nèi)膜異位癥研究發(fā)現(xiàn)，患者腹腔液中巨噬細(xì)胞數(shù)量、炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1和IL-6等水平均明顯高于正常生化指標(biāo)。NF-κB可通過調(diào)控炎癥信號通路中酶的基因轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1等大量表達(dá)。另一方面，NF-κB可以通過阻斷線粒體釋放細(xì)胞色素C而具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，研究發(fā)現(xiàn)Caspase3與Bcl-2存在相互制約的關(guān)系。因此，NF-κB對子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生、發(fā)展具有很重要的作用，極有可能成為潛在治療內(nèi)異癥的靶點(diǎn)。

子宮內(nèi)膜異位癥在育齡婦女中有約10%的發(fā)病率，嚴(yán)重影響了患者的健康及生活。地諾孕素于2011年在加拿大上市，用于治療婦女子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病。臨床研究發(fā)現(xiàn)，地諾孕素可以有效減輕患者內(nèi)異癥引起的骨盆疼痛等癥狀，而且其耐受性好、不良反應(yīng)少。地諾孕素對機(jī)體電解質(zhì)平衡、糖代謝、腎上腺功能和甲狀腺功能無明顯影響，而且地諾孕素?zé)o肝損傷作用，其對凝血機(jī)制和血脂代謝的影響不能成為誘發(fā)心血管疾病的危險(xiǎn)因素。頭痛、不規(guī)則出血和乳房不適是地諾孕素常見的不良反應(yīng)，但是其會隨著治療而逐漸減輕。

總之，地諾孕素有明顯誘導(dǎo)異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞凋亡的作用，它降低了異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞對NF-κB、Bcl-2和Bcl-XL蛋白的表達(dá)，這很可能是地諾孕素治療子宮內(nèi)膜異位癥的潛在作用靶點(diǎn)及作用機(jī)制。

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