無創(chuàng)胎兒RhD分型的研究進展與臨床應用＊

龍宇鵬 綜述，任 君審校

（中國人民解放軍第324醫(yī)院檢驗科，重慶400020）

在妊娠期，Rh血型D抗原陽性胎兒的紅細胞可從胎盤漏出進入RhD陰性的母體內(nèi)，促使其免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的RhD抗體，并進入胎兒循環(huán)并導致胎兒和新生兒發(fā)生同種異體的免疫反應；在分娩時，大量的RhD陽性胎兒紅細胞可進入母體，誘發(fā)RhD陰性血的母體對Rh因子產(chǎn)生抗體，在以后的妊娠中，這些抗體再通過胎盤進入胎兒循環(huán)，攻擊胎兒的RhD陽性紅細胞，引發(fā)了胎兒和新生兒溶血?。╤emolytic disease of the fetus and newborn，HDFN），主要表現(xiàn)為溶血性貧血引發(fā)的胎兒水腫、黃疸、核黃疸以及胎兒宮內(nèi)死亡或新生兒死亡[1]。在孕晚期和分娩過程中，D抗原的風險最高，但D型的免疫反應也可以發(fā)生在早孕和中孕期[2]。胎兒和新生兒溶血性疾病的治療取決于胎兒貧血的嚴重程度，而使用超聲多普勒測定大腦中動脈的收縮期流速是確定胎兒貧血的一種安全、快速的方法。若病情較輕，胎兒可通過增加紅細胞生成來代償紅細胞的破壞。若病情進一步加重則需要進行宮內(nèi)輸血治療或剖宮產(chǎn)終止妊娠，胎兒出生后仍需要進行血液交換或完全性的輸血治療。因此，D型免疫反應是導致HDFN這一嚴重威脅胎兒和新生兒生命的疾病的主要原因。本文將對目前國內(nèi)外關于胎兒RhD的無創(chuàng)分型檢測的研究進展及其在臨床的應用作一綜述。

1 胎兒和新生兒溶血病研究進展

在無免疫預防措施的20世紀50年代，HDFN的發(fā)病率高達1／2 200。到了20世紀60年代晚期，隨著新生兒預防性注射抗D免疫球蛋白的廣泛應用，RhD陰性血婦女發(fā)生D抗原反應的頻率從17%降到1%左右。后來又有研究認為，胎兒出生前進行預防性抗D治療可以將免疫反應降至0.2%[3]。因此現(xiàn)在普遍采用多次產(chǎn)前結合產(chǎn)后預防性注射免疫球蛋白將免疫反應的風險降到最低，產(chǎn)前可以在孕28～29周時單次注射250～300μg或選擇在孕29、34周時分別注射150μg免疫球蛋白；而出生后的預防通常在出生后72h內(nèi)給予單次注射。以往RhD陰性血的孕婦應常規(guī)在分娩前進行預防性治療，因為胎兒的血型直至出生后才能確定。但在歐洲血統(tǒng)的人群中，有40%的RhD陰性孕婦所懷胎兒也是RhD陰性，因此這部分患者不存在D抗原免疫的風險，造成了一定程度的過度治療[3]。

隨著非侵入性產(chǎn)前診斷技術的發(fā)展，出現(xiàn)了母體血中無細胞的胎兒游離DNA（cell-free fetal DNA，cffDNA）的無創(chuàng)分析策略，使胎兒RhD血型可以在出生前得到準確的預測，預防性免疫球蛋白的治療也更具靶向性。目前這一篩查技術已經(jīng)在歐洲乃至全球鋪展開來，并且在丹麥、荷蘭、芬蘭、比利時、瑞士、法國和英國等國胎兒RhD分型已經(jīng)成為產(chǎn)前檢查的常規(guī)項目[3]。也有一些國家將胎兒RhD分型作為RhD陰性孕婦的監(jiān)測項目。

2 RhD血型的特點及臨床應用

Rh血型系統(tǒng)由兩個基因組成，均位于1號染色體上且位置接近（1p34-36.2），均含有10個外顯子，并有94%的序列相同。RhD基因編碼的RhD蛋白上攜帶有D抗原（RH1），RHCE基因編碼的RhCE蛋白上攜帶有C或c、E或e抗原（RH2-5）。目前為止，Rh血型系統(tǒng)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)50多種抗原，251個RhD等位基因和123個RHCE等位基因。這種多態(tài)性增加了從RhD基因型中預測D表型的難度。

攜帶有功能性RhD基因的個體通常表現(xiàn)為D表型陽性。而引起D表型陰性的最常見原因就是RhD基因的缺失，這也成為RhD陰性孕婦胎兒RhD基因檢測的焦點。D陰性表型在不同人群中出現(xiàn)的頻率分別為：歐洲15%～17%、非洲5%、亞洲3%。在非洲人群中，D陰性的表型可能是由于基因缺失，也有約66%的人是攜帶不編碼功能的假基因；而不同的RhD等位基因表達的差異較大，可表現(xiàn)為不表達、弱表達或部分表達D抗原的類型，因此存在RhD基因型的個體并不一定都有D陽性的表型，約有0.2%～1.0%的歐洲人群為D抗原弱表達，部分D表達的人則更少[4]。還有一類表型是DEL型，即只有在抗D抗體吸收和洗脫后才能檢測到RhD表型，這類表型在亞洲人較為常見，在歐洲人群較少，僅占1／350～1／2 000[5]。攜帶有D抗原部分表達基因型的孕婦也應被歸為D陰性人群，并接受預防性治療，因為這類患者也可能與D陽性的胎兒產(chǎn)生免疫反應[6]。由此可見，帶有以上的這些RhD基因型的孕婦，其胎兒RhD基因檢測的復雜性顯著地升高。

3 母血中的胎兒游離DNA及臨床檢測

胎盤合體滋養(yǎng)層含有細胞滋養(yǎng)細胞來源的胎兒細胞核，合體滋養(yǎng)層發(fā)生凋亡后可釋放大量的凋亡小泡進入母體外周循環(huán)，小泡中包含的胎兒有核細胞的DNA片段會隨著小泡的溶解、破裂而混入母血中，形成cffDNA。自從1997年在母體循環(huán)中發(fā)現(xiàn)cffDNA以來，國內(nèi)外的眾多研究團隊均聚焦于這一領域，并在1998年創(chuàng)立了針對RhD陰性孕婦的“基于非侵入性實時PCR的胎兒RhD基因檢測”技術。但cffDNA的生物學功能還遠未闡明。

母血中cffDNA的主要特點是高度碎片化，通常為小于200bp的核酸片段；母血中的cffDNA的出現(xiàn)較早，在孕4～5周時即可檢測到，但水平極低，直到孕7周以后才較為穩(wěn)定，需到孕10～11周才能達到臨床檢測的標準。而且在整個孕期母血中cffDNA的水平均較低，波動在1～1 000copy／mL，從早孕期的20～25copy／mL開始逐漸升高，在中孕期含量約為32 copy／mL，直至晚孕期接近1 000copy／mL才較為容易檢測，分娩后1～2d即消失[7]。母血中cffDNA的水平波動和變異較大，主要是由于容易受到DNA提取方法、檢測技術、定量和定性手段等因素的影響，但根本的原因還是母血中cffDNA水平較低[8]。

實時熒光定量PCR（RT-PCR）法是目前胎兒RhD分型的主要技術[9]，其他用于分析cffDNA的方法包括：基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）[10]、數(shù)字 PCR（digital PCR）和新一代測序技術（NGS）[11]。對于胎兒 RhD分型而言，母血中cffDNA的低水平所導致的最嚴重風險就是檢測結果的假陰性。此外，由于母體血漿cffDNA在孕早期很難檢測到，因此在早孕期檢測假陰性的風險最大，但中孕和晚孕期也有假陰性出現(xiàn)[6]。對于臨床母血cffDNA的檢測，最關鍵的是要確保檢測方法的高穩(wěn)定性和高敏感性以避免假陰性結果出現(xiàn)，必須注意以下幾點：（1）保證全血和血漿中胎兒DNA的穩(wěn)定；（2）保證DNA的高提取率；（3）保證足量的胎兒DNA可用于分析檢測。另外，母血中胎兒DNA的水平還受到運輸、處理、離心和保存等分析前的條件影響，必須嚴格操作。

既往研究表明，cffDNA在母體全血和血漿中均非常穩(wěn)定，并可以在EDTA管中進行數(shù)天的運輸，而不影響胎兒RhD分型的實時PCR檢測結果。cffDNA對環(huán)境溫度的適應性也較好，血樣可在室溫或4℃中保存或運輸多日而不影響DNA水平。長時間的儲存和運輸可導致母體DNA的升高，同時cffDNA比例下降，但這并不會對基于RT-PCR的胎兒RhD檢測法造成負性的影響[12]。DNA的高提取率可以通過多種DNA提取方法實現(xiàn)，包括手工提取試劑盒（病毒核酸提取試劑盒、循環(huán)血核酸試劑盒等）和具有高提取度、高重復性、低誤差率的自動DNA提取法[13-14]。為獲得足量的cffDNA，可以增加母血樣本的總量，目前的方法已經(jīng)可以達到使用1～4mL母體血漿檢測胎兒RhD血型的水平。檢測敏感性的增加與所用方法和策略密切相關，采用多個DNA作為靶標（雙外顯子聯(lián)合法、多重標記法等）可以顯著地增強測定的敏感性[14]。針對cffDNA碎片的特性，臨床檢測應使用短的PCR擴增子以獲得更多完整的模板DNA分子和更高的敏感性[15]。

4 胎兒RhD基因檢測策略

運用PCR方法檢測RhD基因，需要擴增D陽性的變體，也需要高特異性的檢測方法以區(qū)分RHCE。目前的檢測包括RhD的5、7和10號外顯子等多個靶點，可單獨檢測也可聯(lián)合檢測[16]。但多數(shù)學者均推薦至少檢測2個外顯子[17]。有研究采用4、5、6和10號外顯子的聯(lián)合檢測將RhD陰性、陽性與RhD假基因、RhD-CE-Ds變體進行區(qū)分，其準確率可達到100%[18]。但是單獨檢測5號或10號外顯子均有因該外顯子為陰性而出現(xiàn)假陽性的檢測結果[19]。也有胎兒RhD檢測策略是使用10號外顯子確定D抗原的變體，因為大多數(shù)雜合型等位基因均在此處隱藏；這種策略雖容易增加假陽性的預測結果，但對于臨床診斷是必要的。另外，鑒于RhD基因頻率的分布因地域差異而變，因此不同的實驗室必須根據(jù)實際情況和胎兒RhD分型的臨床目的（用于科學研究或人群篩查）設計檢測的具體策略以適應當?shù)氐奶厥馊巳篬20]。

5 免疫異常孕婦的胎兒RhD分型

如果D抗原陰性孕婦的胎兒為RhD陽性，則導致其出現(xiàn)免疫異常，發(fā)生D型免疫反應的風險較大。因此，正確地評估這些孕婦發(fā)生D型免疫反應的風險對于這些孕婦的管理非常重要。若胎兒為RhD陽性，則需接受相應的監(jiān)測和治療；若為陰性則可以免受不必要的治療。在全世界范圍內(nèi)，胎兒RhD分型都是一個綜合性的需要高精度結果的臨床服務項目?？傮w上，預測精確度和檢測敏感性在過去的15年中有了極大提高，從95%提高至接近100%，孕早期進行產(chǎn)前預測的可靠性已達到較高水平[20]。而且，RhD陰性結果的檢出必須明確，盡量減少假陰性的出現(xiàn)。為了增加胎兒RhD表型的準確性，常常采用多個外顯子同時檢測的策略[21]。在既往采用2種外顯子分型的研究中已經(jīng)得到了較高的準確性；此外，利用MALDI-TOF MS分析技術和早孕期的檢測方法等也均已經(jīng)得到了良好的檢測結果，但是假陰性的結果依然無法避免。

為了保證胎兒D陰性表型預測的質(zhì)量，可將通用的胎兒RhD陰性基因作為對照，也有利用多態(tài)性的標記結合Y染色體分析，或利用單核苷酸多態(tài)性進行分析。有研究認為，RASSF1A基因啟動子甲基化BstUI抗性可能會成為cffDNA分析的可靠對照而廣泛應用。但胎兒對照組必須與檢測目標的敏感性在總體上相一致。有些研究為了保證檢測質(zhì)量，排除母體RhD基因變異對胎兒檢測結果的掩蓋，分別在不同孕周抽取血樣進行獨立檢測。也有研究者采用兩個RhD外顯子檢測聯(lián)合總DNA作為DNA提取技術的對照。另外，數(shù)字化PCR近年來也應用于母血含有RhD變體的檢測中，而且，數(shù)字化PCR、NGS等新興技術可以克服傳統(tǒng)RhD分型技術的局限，具有潛在的開發(fā)價值。為了達到臨床應用和推廣的目的，檢測RhD的相關工作強度也必須符合常規(guī)的臨床檢驗標準[22]。

與檢測孕婦RhD血型不同，產(chǎn)前胎兒的RhD分型主要的研究目標就是降低假陰性率，而假陽性的結果不會導致嚴重的臨床后果。作為篩查方案，必須采用高成本效率、高樣本處理量和快速的檢測方法。按照目前的RHD篩查經(jīng)驗，僅有極少數(shù)研究結果中出現(xiàn)了假陰性，且這些結果的出現(xiàn)并非由于母體血cffDNA的低水平，而是樣本中混入雜質(zhì)或處理失誤所致[23]。

6 胎兒RhD分型與產(chǎn)前治療方案

對于胎兒D抗原弱表達的孕婦，可以歸為RhD陽性胎兒組，也可歸為結果不明確組，在初診時預防性使用抗D抗體進行治療；但1～3型的弱陽性孕婦可以不必進行治療[24]。對于攜帶有RhD假基因的孕婦也應按照上述方法歸類并進行預防性治療，并根據(jù)這些基因變體的頻率涉及適當?shù)姆桨?，盡量排除不需治療的個體。既往研究顯示，有約0.3%～2.3%的孕婦因檢測結果假陽性或歸為結果不明確組而接受了原本不需要的預防性治療，針對這部分患者的正確診斷仍有提升空間[3]。

胎兒RhD分型陽性的孕婦，產(chǎn)前靶向預防性治療方案的實施需要一大群衛(wèi)生專業(yè)人員的參與，包括專科醫(yī)師、通科醫(yī)師、助產(chǎn)士、實驗室技術人員的工作和衛(wèi)生管理機構的認可，參與者之間的通力協(xié)作對于方案的成功至關重要。越來越多的研究提示：高依從性是治療項目實施和成功避免D抗原免疫反應的關鍵因素[23]。

然而，對于出生后的新生兒，臍帶血血型檢測原本是一種更加安全、廉價的RhD分型方法，同時也可以作為產(chǎn)前胎兒RhD分型結果不可信或不明確時的一種有效補救措施，但是最近在荷蘭、丹麥等國被停用，其原因一方面是因為已經(jīng)有研究顯示其不能成為篩查結果的一個精確的標記，另一方面是其質(zhì)量控制和保障尚不完善。美國國家生物標準和控制研究所（National Institute for Biological Standards and Control，NIBSC）已經(jīng)制定了血漿的臨床生物檢測標準，規(guī)范的cffDNA檢測標準尚未完成[25]。

7 小結與展望

綜上所述，無創(chuàng)胎兒RhD分型技術是建立在cffDNA高度自動化、高敏感性檢測的基礎上，使用多種外顯子作為檢測靶點以降低假陰性率，必將發(fā)展成一種穩(wěn)定的常規(guī)篩查方法，用以指導產(chǎn)前預防性治療。在其廣泛應用的過程中可從多個方面進行成本和耗費控制水平的提升：（1）采用簡單、廉價、有效的方法提高檢測敏感性，降低篩查的整體費用；（2）采用多種自動或手動的措施，降低假陰性率，減少不必要的產(chǎn)前治療費用；（3）取代其他高成本的篩選或檢測技術，獲得更多的衛(wèi)生經(jīng)濟學效益；（4）在孕早期進行確診性篩查，及早發(fā)現(xiàn)RhD血型信息及其他免疫反應條件的信息，進行早期預防，節(jié)約后期治療成本；（5）應用于 HDFN相關的其他同類血型抗原（Rhc、RhE、Kell、HPA等）的評估和檢測體系中，減少其他抗原分型的研究和診治成本。因此基于cffDNA的無創(chuàng)RhD血型檢測技術是一項極具研究價值和臨床價值的重要方法。

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