抗菌肽促進(jìn)創(chuàng)傷愈合研究進(jìn)展

蔣 艷 綜述，王仙園 審校

（第三軍醫(yī)大學(xué)護(hù)理學(xué)院：1.基礎(chǔ)護(hù)理學(xué)教研室；2.野戰(zhàn)護(hù)理學(xué)教研室，重慶400038）

抗菌肽（antibacterial peptide），由10～50個(gè)氨基酸組成，存在于上皮和免疫組織中，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤活性，人類抗菌肽構(gòu)成了機(jī)體先天性免疫系統(tǒng)的第一道防線，被廣泛研究[1]。目前越來(lái)越多的研究表明，抗菌肽的作用遠(yuǎn)不止于此，它廣泛參與維持機(jī)體完整性的一系列相關(guān)生物學(xué)活動(dòng)，包括創(chuàng)傷修復(fù)[2]。國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道較少，現(xiàn)將其中3種抗菌肽與創(chuàng)傷修復(fù)研究進(jìn)展綜述如下。

1 LL-37

人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的惟一的cathelicidins抗菌肽家族成員，含37個(gè)氨基酸，主要表達(dá)于某些骨髓源性細(xì)胞（中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等）、角質(zhì)形成細(xì)胞、組織上皮細(xì)胞及某些腺體等易與微生物發(fā)生接觸的部位，能被感染或創(chuàng)傷誘導(dǎo)產(chǎn)生。研究已證實(shí)LL-37對(duì)革蘭陰性和陽(yáng)性菌有廣譜抗菌作用[3]。而Dorschner等[4]在皮膚無(wú)菌手術(shù)創(chuàng)緣檢測(cè)到LL-37高表達(dá)，推測(cè)可能與創(chuàng)傷愈合相關(guān)。創(chuàng)傷愈合是一個(gè)被多種生長(zhǎng)因子和特異性胞內(nèi)信號(hào)通路調(diào)節(jié)的有序過(guò)程，涉及炎癥、細(xì)胞增殖、遷移及血管再生等多個(gè)環(huán)節(jié)，目前研究逐步發(fā)現(xiàn)LL-37能夠通過(guò)多種途徑參與傷后上皮重建。

Heiborn等[5]發(fā)現(xiàn)，皮膚受急性創(chuàng)傷后，LL-37表達(dá)增強(qiáng)，48h達(dá)到高峰，創(chuàng)面愈合后表達(dá)恢復(fù)正常；而慢性難愈性潰瘍創(chuàng)面雖LL-37mRNA高表達(dá)，但其蛋白水平低下，推測(cè)與其基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程障礙有關(guān)，由此提出LL-37水平與創(chuàng)傷正常愈合相關(guān)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，LL-37抗體能推遲組織工程皮膚創(chuàng)傷修復(fù)，且表皮細(xì)胞表面增殖免疫標(biāo)記物Ki67缺失，提示LL-37可能是通過(guò)影響表皮細(xì)胞增殖功能，進(jìn)而促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)。而Carretero等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，LL-37可以通過(guò)誘導(dǎo)皮膚表皮Hacat細(xì)胞株遷移表型改變，活化黏附相關(guān)激酶，加速該細(xì)胞遷移；而對(duì)手術(shù)后大鼠外源性局部補(bǔ)充LL-37，肉芽組織形成和上皮再生速度加快。除對(duì)細(xì)胞增殖和遷移功能的影響外，LL-37能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖而誘導(dǎo)新生血管形成。Koczulla等[7]發(fā)現(xiàn)，缺乏LL-37基因表達(dá)的大鼠創(chuàng)傷后新生血管減少，推測(cè)LL-37介導(dǎo)的血管再生是體內(nèi)皮膚創(chuàng)傷新生血管形成的重要環(huán)節(jié)，再次強(qiáng)調(diào)了LL-37在創(chuàng)傷修復(fù)中的應(yīng)用潛力。

除皮膚組織外，LL-37對(duì)其他部位的創(chuàng)傷愈合同樣能起到促進(jìn)作用。Shyakhiev等[8]發(fā)現(xiàn)，LL-37在體外能促進(jìn)氣管上皮細(xì)胞以及氣管標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞株NCI-H292增殖和遷移，參與氣道創(chuàng)面修復(fù)。另有研究者將LL-37用于高糖環(huán)境下組織工程角膜組織，發(fā)現(xiàn)角膜 HCECs細(xì)胞株劃痕創(chuàng)傷愈合加快[9]。Wu等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，鼠cathelicidin家族成員rCRAMP與胃組織創(chuàng)傷修復(fù)有關(guān)，胃潰瘍創(chuàng)面rCRAMP表達(dá)上調(diào)，rCRAMP基因治療通過(guò)刺激血管再生、細(xì)胞增殖加速潰瘍面愈合。

目前多數(shù)研究認(rèn)為，LL-37促進(jìn)創(chuàng)傷愈合由受體介導(dǎo)。LL-37作用皮膚表皮細(xì)胞后10min即能檢測(cè)出表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）磷酸化，使用STAT3通路顯性失活突變體轉(zhuǎn)染角質(zhì)細(xì)胞可以抑制LL-37誘導(dǎo)的遷移功能，提示LL-37的促遷移活性主要與EGFR以及下游STAT3通路有關(guān)[11]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，LL-37作用下，Hacat細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶和胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶，EGFR或G蛋白偶聯(lián)受體共同活化，促進(jìn)細(xì)胞遷移[6]。LL-37對(duì)氣道表皮細(xì)胞作用的機(jī)制與之類似，由EGFR、G蛋白偶聯(lián)受體、MAP／胞外調(diào)控通路介導(dǎo)[8]。而LL-37活化高糖環(huán)境下角膜細(xì)胞功能的機(jī)制研究顯示，LL-7能部分恢復(fù)高糖抑制的EGFR途經(jīng)，延長(zhǎng)該通路對(duì)創(chuàng)傷的反應(yīng)，提示LL-37可能是EGFR通路的增強(qiáng)劑[9]。而鼠rCRAMP促進(jìn)胃黏膜上皮細(xì)胞增殖主要通過(guò)EGFR反式激活及下游的ERK1／2通路介導(dǎo)。由此，許多研究者提出LL-37可能是表皮細(xì)胞的又一類生長(zhǎng)因子[10]。但具體的LL-37作用通路仍需深入研究。

2 富組蛋白家族（histatins，Hsts）

Hsts是涎腺特異性產(chǎn)物，僅存在于人類和其他靈長(zhǎng)類動(dòng)物唾液中，由12個(gè)成員組成，以 Hst1、Hst3、Hst5為主要成員，占總量的95%，三者含量比為1∶3∶1，其中，Hst1、Hst3、Hst5是主要的研究對(duì)象[12]。目前，研究認(rèn)為Hsts對(duì)以口腔黏膜細(xì)胞為代表的多種細(xì)胞具有促增殖或遷移功能。

Oudhoff等[13]利用體外創(chuàng)傷愈合模型研究唾液成分與口腔黏膜創(chuàng)傷愈合的相關(guān)性，認(rèn)為富組蛋白家族是促進(jìn)口腔黏膜創(chuàng)傷快速愈合的主要影響因子，且在生理濃度5～100μg／mL范圍內(nèi)均具有活化細(xì)胞能力。此后，研究者考察了Hsts對(duì)原代口腔黏膜上皮細(xì)胞、口腔成纖維細(xì)胞功能的影響，結(jié)果一致，據(jù)此推測(cè)富組蛋白具有維持口腔黏膜組織結(jié)構(gòu)完整性的功能[14]。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，僅腮腺唾液能顯著促進(jìn)創(chuàng)傷愈合外，而其他涎腺唾液幾乎無(wú)此功能，可能與其他涎腺分泌黏蛋白抑制細(xì)胞遷移和黏附有關(guān)，但黏蛋白與Hsts之間的相關(guān)性尚不明了[15]。Hsts促口腔黏膜創(chuàng)傷愈合的機(jī)制也不清楚，僅認(rèn)為其促愈機(jī)制與其抗真菌機(jī)制不同，也不同于其他抗菌肽促愈合機(jī)制?，F(xiàn)有的相關(guān)性結(jié)論是Hsts作用不依賴于EGFR，與上皮細(xì)胞作用可能是通過(guò)與G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合后內(nèi)吞，產(chǎn)生一系列效應(yīng)。初步發(fā)現(xiàn)Hst2促創(chuàng)傷愈合的活性能被ERK1／2通路抑制劑削弱，但該蛋白影響細(xì)胞功能具體的胞內(nèi)信號(hào)途徑以及活化過(guò)程有待進(jìn)一步研究。另外Hst2作用具有結(jié)構(gòu)立體特異性，D-Hst2無(wú)促進(jìn)口腔黏膜細(xì)胞遷移功能[13]。

盡管富組蛋白僅在唾液內(nèi)表達(dá)，至今未在其他體液內(nèi)發(fā)現(xiàn)，但有研究提示該蛋白對(duì)某些非口腔細(xì)胞同樣具有活化功能。Murakami等[16]研究發(fā)現(xiàn)，Hst5呈劑量依賴性促進(jìn)兔肋軟骨細(xì)胞DNA合成，并發(fā)現(xiàn)Hst5與EGF具有顯著協(xié)同作用，聯(lián)合使用能顯著提高該細(xì)胞DNA合成率近40倍，認(rèn)為Hst5可能是EGF的生理調(diào)節(jié)劑。Oudhoff等[14]研究也發(fā)現(xiàn)，Hst2能促進(jìn)人成纖維細(xì)胞遷移，而促增殖作用較弱，參與創(chuàng)傷愈合早期，且無(wú)細(xì)胞毒性和促炎性反應(yīng)功能。這為合成富組蛋白用于皮膚創(chuàng)傷修復(fù)治療提供了實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。此外，Hst2還可以促進(jìn)乳腺癌來(lái)源的表皮細(xì)胞株MCF7體外創(chuàng)面愈合。綜上推測(cè)富組蛋白受體不僅僅存在于口腔來(lái)源細(xì)胞。筆者在體外利用人工合成Hst1作用與人表皮細(xì)胞Hacat細(xì)胞株及成纖維細(xì)胞株體外劃痕創(chuàng)傷，發(fā)現(xiàn)人工劃痕修復(fù)速度加快[17]。

由于口腔黏膜創(chuàng)傷較皮膚創(chuàng)傷具有愈合速度快，愈后無(wú)瘢痕的優(yōu)勢(shì)，因此，Hsts對(duì)包括皮膚組織在內(nèi)的創(chuàng)傷修復(fù)作用究竟如何，作用機(jī)制是什么值得進(jìn)一步研究。

3 人防御素（defensins）

防御素，含12～50個(gè)氨基的陽(yáng)離子蛋白，在人類該家族包括α-及β-兩組成員。α-1、2、3、4由中性粒細(xì)胞產(chǎn)生，α-5、6由腸組織腺體分泌，β-防御素主要由包括皮膚和呼吸道在內(nèi)的上皮組織產(chǎn)生[18]。

研究顯示，燒傷、急性或慢性創(chuàng)傷后，在IL-7、TNF-α和IL-1等細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子作用下，或細(xì)菌（如金黃色葡萄球菌）刺激，防御素表達(dá)增加，相關(guān)的信號(hào)通路包括TLR／NF-κB，p38MAPK和JAK／STAT；而增加的防御素繼而活化MARK、Akt、STAT1、STAT3通路，并活化細(xì)胞內(nèi) Ca2＋，EGFR磷酸化，刺激創(chuàng)傷修復(fù)細(xì)胞，促進(jìn)成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和遷移，從而加快皮膚創(chuàng)面愈合。另有研究者發(fā)現(xiàn)，人工合成的防御素能促進(jìn)皮膚成纖維細(xì)胞前膠原蛋白和mRNA的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-1表達(dá)，以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積而加快傷口愈合，提示防御素具有促進(jìn)生物合成和組織重塑反應(yīng)的作用[19]。β-防御素在刺激血管生成方面的作用與與VEGF相似，但在VEGF抗體作用下時(shí)仍能夠刺激血管網(wǎng)絡(luò)形成，提示防御素促進(jìn)血管的形成機(jī)制不同于VEGF。

此外，防御素對(duì)氣道、角膜、腸道損傷的修復(fù)同樣能起到加速作用[20-22]。研究發(fā)現(xiàn)低濃度的（≤10μg／mL）的防御素即能通過(guò)活化氣道上皮細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)株EFFR和ERK1／2通路，促進(jìn)該細(xì)胞的遷移及增殖，而加速氣道上皮創(chuàng)傷愈合；同時(shí)，可誘導(dǎo)糖蛋白MUC5B、MUC5AC的表達(dá)，與氣道上皮細(xì)胞分化有關(guān)。防御素對(duì)腸道上皮創(chuàng)傷的愈合作用以促進(jìn)上皮細(xì)胞遷移為主，對(duì)其增殖作用較弱，同時(shí)可促進(jìn)其表達(dá)黏蛋白2、3，改善凋亡。而角膜或結(jié)膜創(chuàng)傷后，淚液中的防御素表達(dá)水平增加，提示其可能參與創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程。

目前，臨床發(fā)現(xiàn)耐藥菌株大量出現(xiàn)是影響創(chuàng)面感染控制的一大障礙，因此，一方面這些宿主抗菌肽在抵抗病原微生物上表現(xiàn)出極大的應(yīng)用前景，另一方面抗菌肽可能是一種影響創(chuàng)傷愈合的直接細(xì)胞信號(hào)分子，對(duì)皮膚再生具有潛在的治療性作用，有一定的研究?jī)r(jià)值[23-24]。當(dāng)前面臨的挑戰(zhàn)是：抗菌肽促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的機(jī)制，胞內(nèi)信號(hào)途徑究竟如何；如何建立有效的動(dòng)物模型，雖然許多抗菌肽在體外是具有活性的，但體內(nèi)模型中超過(guò)生理濃度的抗菌肽（除富組蛋白外）對(duì)宿主往往是具有毒性的，局部用藥治療能否幫助克服這種臨床障礙；如何設(shè)計(jì)抗菌肽治療藥物，在保留促創(chuàng)傷修復(fù)能力的同時(shí)降低其細(xì)胞毒性[25]。

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