治療椎間盤退變的生物學(xué)療法＊

劉桓江 綜述，張 柳，王文雅 審校

（河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，河北唐山063000）

低位腰痛是椎間盤退變患者就診的最常見起因，也是影響成年人生活和工作能力的重要因素[1]。椎間盤切除術(shù)和脊柱融合術(shù)是常用的緩解疼痛的方法，但并不能恢復(fù)椎間盤的功能[2]。椎間盤源性的疼痛是由椎間盤炎癥、神經(jīng)支配增多以及椎間盤負(fù)荷過度引起的。椎間盤疾病的生物學(xué)療法近來被廣泛研究，修復(fù)和重塑椎間盤主要通過以下3條途經(jīng)：生物分子療法、細(xì)胞療法、組織工程方法。以下將總結(jié)各種方法最新的研究進(jìn)展，并且重點(diǎn)總結(jié)其應(yīng)用優(yōu)勢和局限性。

1 生物分子療法

合成代謝和分解代謝的平衡是維持健康椎間盤內(nèi)環(huán)境的重要因素，打破平衡會導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的流失。生物分子療法的目的是誘導(dǎo)細(xì)胞減少分解因子的產(chǎn)生，或者增加合成因子的產(chǎn)生，從而促使細(xì)胞外基質(zhì)再生。生物分子和基因療法能夠在蛋白和基因水平改變細(xì)胞生物合成。若使這些方法有效，必須在組織中有大量的可利用細(xì)胞，使靶分子得到重組表達(dá)。由于這些原因，既往研究認(rèn)為分子生物學(xué)療法在椎間盤退變的早期階段更有效。以下是幾種分子生物學(xué)方法治療椎間盤退變的研究。

1.1 促進(jìn)基質(zhì)合成代謝 生長因子通過刺激基質(zhì)合成進(jìn)而調(diào)節(jié)椎間盤細(xì)胞新陳代謝。轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor-β，TGF-β）和骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMPs）能夠通過調(diào)節(jié)椎間盤細(xì)胞中糖胺聚糖、蛋白多糖、Sox9和2型膠原的含量促進(jìn)軟骨的形成[3-4]。當(dāng)把動物的髓核細(xì)胞培養(yǎng)在含有TGF-β和BMP-2的培養(yǎng)基中時，二者能正向調(diào)節(jié)1型膠原、糖胺聚糖及2型膠原mRNA的表達(dá)[5]。血小板衍生因子（platelet derived growth factor，PDGF）、成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和胰島素樣生長因子（insulinlike growth factor，IGF-1）這3種蛋白分裂素，已經(jīng)被證實(shí)能刺激牛髓核細(xì)胞增殖。最近，Kim等[6]證實(shí)IGF-1在牛的髓核細(xì)胞中能夠增強(qiáng)合成代謝，并能提高BMP-7的作用。Gruber等[7]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)退變的纖維環(huán)細(xì)胞處于IGF-1和PDGF中時，細(xì)胞凋亡加強(qiáng)。Wang等[8]把BMP-7和動物椎間盤細(xì)胞培養(yǎng)在藻酸鹽凝膠中，證實(shí)能促進(jìn)蛋白多糖合成。Masuda等[9]在動物的椎間盤退變模型中注射BMP-7，椎間盤的生物化學(xué)成分得到修復(fù)。Imai等[10]將人重組BMP-7注射進(jìn)動物的椎間盤中，增加了椎間盤高度。相對于重組生長因子而言，合成肽可能是一種更有效更安全的生物分子。已證實(shí)Link N是一種具有類似生長因子功能的合成肽，能有效刺激糖胺聚糖基因表達(dá)并且抑制蛋白酶的表達(dá)[11-12]。

1.2 基因療法 由于生物分子半衰期較短，所以研究一種長效的治療方法顯得尤為重要。基因療法已經(jīng)被用作一種增強(qiáng)椎間盤細(xì)胞新陳代謝的方法。慢病毒載體和腺病毒相關(guān)載體（adenoviral-associated vectors，AAV）已經(jīng)被應(yīng)用于修復(fù)椎間盤組織。Leckie等[13]發(fā)現(xiàn)，AVV2能引起椎間盤細(xì)胞產(chǎn)生BMP-2或TIMP-1蛋白，延緩?fù)俗?。但是在這些載體應(yīng)用于臨床之前其本身的免疫原型和其基因產(chǎn)物的長期療效仍然是一個亟待解決的問題。

1.3 抑制基質(zhì)分解代謝 促炎因子已經(jīng)被證實(shí)能促使椎間盤退變，并且與退變時間相關(guān)。退變椎間盤細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1和腫瘤壞死因子α（TNF-α），均是蛋白酶的間接產(chǎn)物，而且基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和蛋白聚糖酶能夠分解基質(zhì)。最近Sinclair等[14]在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)可溶性TNF-α受體能明顯減弱TNF-α在人椎間盤細(xì)胞中的作用，并且在一定程度上可以下調(diào)NO、PGE2和IL-6。Chubinskaya等[15]在一個大鼠椎間盤退變模型中證實(shí)BMP-7通過降低蛋白酶和細(xì)胞因子及疼痛相關(guān)蛋白水平使分解代謝降低。在椎間盤退變過程中siRNA分子能抑制干擾蛋白。在動物椎間盤退變模型中，Seki等[16]證實(shí)單獨(dú)注射蛋白聚糖酶siRNA能抑制退變并且能重塑髓核組織。這些療法的重點(diǎn)是提高髓核細(xì)胞的代謝功能而不增加細(xì)胞數(shù)量，但是細(xì)胞功能降低、營養(yǎng)缺乏、低氧及衰老這些因素都會使療效下降。因此生物療法聯(lián)合細(xì)胞或生物材料成為新的趨勢。

2 細(xì)胞療法

退變的椎間盤細(xì)胞失去自身修復(fù)能力，所以細(xì)胞移植能夠提供健康細(xì)胞用來再生細(xì)胞外基質(zhì)。有學(xué)者認(rèn)為椎間盤退變起始在髓核，因此合成蛋白多糖、膠原和基質(zhì)蛋白的各種細(xì)胞之間具有較高關(guān)聯(lián)性。此類細(xì)胞具有成熟椎間盤細(xì)胞、關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的所有表型[17]。

2.1 椎間盤細(xì)胞 分化的椎間盤細(xì)胞能合成必需的細(xì)胞外基質(zhì)分子，用于治療或重建椎間盤微環(huán)境。在沙鼠等椎間盤退變模型中，椎間盤細(xì)胞能限制基質(zhì)破壞，促進(jìn)椎間盤高度恢復(fù)，并能合成新的蛋白多糖和1、2型膠原[18]。Benz等[19]發(fā)現(xiàn)，羊的椎間盤能自發(fā)修復(fù)，但是椎間盤細(xì)胞的注入加速了修復(fù)過程。在臨床試驗(yàn)中，通過微創(chuàng)術(shù)將移植細(xì)胞注入到患者體內(nèi)，疼痛癥狀明顯緩解。在注入細(xì)胞2年后，相對那些單純做椎間盤切除術(shù)的患者椎間盤液體含量增加。但這種方法需要獲得椎間盤細(xì)胞，因此這就會導(dǎo)致2次創(chuàng)傷性手術(shù)，增加了感染和損傷神經(jīng)根的概率。況且，在體外培養(yǎng)時，從患者退變組織獲得的椎間盤細(xì)胞分化能力不強(qiáng)，并且喪失了產(chǎn)生糖胺聚糖和2型膠原的能力[20]。盡管椎間盤細(xì)胞能通過生物分子或者3D培養(yǎng)再分化，但是這并不能達(dá)到正常細(xì)胞水平[21-22]。由于這些原因，軟骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞成為新的研究方向。

2.2 軟骨細(xì)胞 近來，在豬去髓核模型中，將培養(yǎng)的自體軟骨細(xì)胞運(yùn)送到體內(nèi)3個月后，軟骨形成密度增加，并且在移植12個月后細(xì)胞活力上升[23]。Arana等[24]在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)軟骨組織通過調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)能刺激髓核細(xì)胞合成。然而軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白多糖與膠原的比值比髓核細(xì)胞低。與髓核細(xì)胞相似，軟骨細(xì)胞移植也面臨一樣多的問題（如二次創(chuàng)傷和供體組織的缺乏），因此軟骨細(xì)胞可能并不是最好的細(xì)胞療法。

2.3 間充質(zhì)干細(xì)胞 Jin等[25]認(rèn)為，MSCs是椎間盤修復(fù)更好的選擇，因?yàn)檫@些細(xì)胞有單獨(dú)分化的能力并且能在椎間盤基質(zhì)中產(chǎn)生蛋白多糖和膠原。MSCs的獲取途徑很多，可以提供合適的自體細(xì)胞來源。而且能在體外擴(kuò)增到臨床所需要的數(shù)量并能以未分化祖細(xì)胞的形式注射到體內(nèi)，分化成與椎間盤細(xì)胞相類似的表型。在動物的退變模型中，與沒有注射組相比，MSCs注射組最小化了椎間盤高度的降低，并使GAG的水平在16周后增加，而干細(xì)胞組和髓核細(xì)胞注射組差異無統(tǒng)計學(xué)意義[26]。在體外實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)與健康髓核細(xì)胞共同培養(yǎng)時，MSCs分化成一種類似髓核細(xì)胞的表型，有抑制糖胺聚糖和SOX9的作用。當(dāng)MSCs與退變的髓核細(xì)胞一起培養(yǎng)時，髓核細(xì)胞能產(chǎn)生更多的蛋白多糖和膠原。最近的研究發(fā)現(xiàn)MSCs和髓核細(xì)胞的主要聯(lián)系是二者膜成分的雙向改變[27-29]。MSCs不僅具有促進(jìn)基質(zhì)合成作用，還可以降低椎間盤中的炎性反應(yīng)[30]。在體外培養(yǎng)中，干細(xì)胞能誘導(dǎo)髓核細(xì)胞抑制基質(zhì)退變的相關(guān)分子基因的表達(dá)，如MMPs和炎癥因子。干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用，包括其表達(dá)Fas配體（免疫細(xì)胞中一種跨膜蛋白）的能力，是通過合成抗免疫反應(yīng)因子（尤其是TGF-β）來降低免疫反應(yīng)的[31]。然而對體內(nèi)干細(xì)胞產(chǎn)生抗免疫反應(yīng)因子的機(jī)制還不是完全明白。自體MSCs療法是有效的，能明顯緩解疼痛降低殘疾率，并且沒有并發(fā)癥，能使椎間盤中液體含量明顯增加，然而椎間盤高度在治療12個月后沒有增加。這與先前的動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，MSCs能抑制椎間盤脫水的過程并能誘導(dǎo)水分的獲取。自體MSCs注入到兩位椎間盤退變患者2年后，其疼痛癥狀減輕并且椎間盤液體含量增多。然而這些研究周期較短，并且患者數(shù)量較少，難以確定感染和其他并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險。然而MSCs抑制的長期療效和分化能力還需要進(jìn)一步研究。

3 組織工程療法

單純地將生物分子和細(xì)胞共同注射進(jìn)椎間盤雖然可以再生組織，但是退變早期細(xì)胞和基質(zhì)流失嚴(yán)重，此時需要大量的因子和細(xì)胞。因此組織工程將細(xì)胞、運(yùn)載支架、生物力學(xué)和生物化學(xué)條件相結(jié)合，其優(yōu)點(diǎn)是可整合并重塑椎間盤結(jié)構(gòu)及功能。

3.1 仿生學(xué)方法模擬椎間盤組織 支架結(jié)構(gòu)作為細(xì)胞附著和引導(dǎo)組織生長的一種支撐，如果惰性植入則只提供生理支撐，沒有轉(zhuǎn)變細(xì)胞生物活性的作用；如果活性植入，會產(chǎn)生生物活性分子引導(dǎo)細(xì)胞生物合成。理想的支架既可以提供生物力學(xué)作用，又可以使新基質(zhì)沉積而增強(qiáng)負(fù)荷能力。水凝膠支架可以保持新沉積的蛋白多糖含量。含藻酸鹽和瓊脂糖并以水凝膠為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基已經(jīng)應(yīng)用于髓核培養(yǎng)。水凝膠由透明質(zhì)酸組成，可以保持髓核表型，并維持其生物力學(xué)。最近的研究的熱點(diǎn)是如何提高支架材料性能，嘗試聯(lián)合膠原分子或聚合凝膠的方法提高拉力并壓縮機(jī)械組成。EP依附于纖維環(huán)和髓核纖維，并且與椎體相鄰近。Fernando等[32]用一種混合模型，證實(shí)EP能提供一種黏附力，能夠減弱在骨與椎間盤連接處的負(fù)荷。EP細(xì)胞含有特殊因子，能刺激蛋白多糖合成，并能抑制TNF-α，說明髓核與EP在內(nèi)環(huán)境中存在交聯(lián)。另外，在組織生長和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中，人造生物反應(yīng)器能被用于再生其物理功能。See等[33]將MSCs培養(yǎng)在含絲的支架中，其周圍被一個硅做的椎間盤包繞，形成一種類似椎間盤結(jié)構(gòu)的東西。將其培養(yǎng)在一種自定義的生物反應(yīng)器中，持續(xù)壓縮椎間盤4周，這種結(jié)構(gòu)被徑向拉伸，導(dǎo)致2型膠原和細(xì)胞外基質(zhì)增加，使之與內(nèi)層纖維環(huán)相似。因此，生物反應(yīng)器可以應(yīng)用于工程組織，其性能更接近于正常的組織。

3.2 臨床移植的障礙 組織工程仍然處于起步階段，組織工程治療中支架材料的切開移植勢必?fù)p傷原本完整的纖維環(huán)結(jié)構(gòu)，引起炎性反應(yīng)，從而加重椎間盤退變。另外載體支架的仿生學(xué)性能并未達(dá)到我們的期望，在今后的研究中組織工程將會完善這些問題，為臨床治療提供更有力的保障。

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