過量氟引起成骨細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路的基因差異表達＊

張亞樓，孫小娜，馮樹梅，李 甜，廖禮彬，白生賓，鐘近潔△

（1.新疆醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院組織胚胎學教研室，烏魯木齊830011；2.新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心放射衛(wèi)生科，烏魯木齊830001）

氟中毒是一種慢性全身性疾病，可致氟斑牙和氟骨癥。地方性氟中毒是我國流行最為廣泛、病情最為嚴重的重點地方病之一[1]。目前，氟中毒機制仍不清楚。研究表明染氟成骨細胞存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[2-3]。但是對于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路在染氟成骨細胞中的表達，未見報道。本研究用氟化鈉（NaF）干預(yù)體外培養(yǎng)的人成骨肉瘤細胞Saos-2，應(yīng)用熒光定量PCR Array技術(shù)和蛋白免疫印跡法（Western blot）觀察對成骨細胞中未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）信號通路的差異基因蛋白表達，為揭示過量氟暴露下成骨細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生特點和開發(fā)相應(yīng)的藥物保護劑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 NaF，分析純（上海生工）；人成骨肉瘤細胞Saos-2購于上海細胞庫；AnnexinⅤ凋亡檢測試劑盒（Invitrogen）；MTS細胞增殖分析試劑盒（Promega）；RNeasy Plus Mini Kit；RT2First Strand Kit（Qiagen）；RT2SYBR Green qPCR Mastermix（Qiagen）；PCR 芯片（PAHS-089ZA-2）購于 Qiagen公司；實驗中所用一抗BIP、XBP1、ATF4、IRE1、CHOP、EIF2S1、β-actin均購自Abcam公司，羊抗兔辣根過氧化物酶（HRP）二抗、羊抗鼠HRP二抗購自武漢博士德。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) Saos-2在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱進行貼壁培養(yǎng)，每2～3天根據(jù)細胞生長的密度和培養(yǎng)液酸堿度的變化更換培養(yǎng)液，當細胞匯合達度到80%進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細胞增殖 Saos-2細胞生長處于對數(shù)生長期時，胰酶消化成單細胞懸液。細胞計數(shù)后以2×104細胞接種于96孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)。NaF用培養(yǎng)液配制，濃度分別為5、10、20、40、80mg／L，同時設(shè)立空白對照（對照組）。染氟時間為24h。每孔100μL培養(yǎng)基加入20μL MTS，酶標儀檢測吸光度值，檢測波長490nm。每種處理劑量設(shè)置5個復(fù)孔。

1.2.3 凋亡細胞的流式細胞儀檢測 將Saos-2細胞接種于25cm2的培養(yǎng)瓶中，待細胞長至鏡下細胞融合度為80%時，加入 NaF（0、5、10、20、40、80mg／L）作用24h后，再加入0.25%胰酶消化細胞，制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×106個／mL，用AnnexinⅤ和PI雙染色在流式細胞儀上進行早期細胞凋亡的檢測。

1.2.4 PCR芯片檢測 將NaF（0、10mg／L）干預(yù)Saos-2細胞24h后，提取RNA。NANODROP分光光度計測定其濃度，瓊脂糖凝膠電泳測定其RNA完整性。取400ng RNA前轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用Qiagen公司RT2Profiler PCR Array進行熒光定量檢測，將cDNA模板適當稀釋后加入到實時熒光定量PCR（RT-PCR）反應(yīng)混合液中，然后在含有基因特異性引物的96孔板各孔中加入等量反應(yīng)液，于RT-PCR儀（Eppendorf Mastercycler ep realplex 2）上進行RT-PCR反應(yīng)。計算每張PCR芯片中的每個基因的Ct值。每種處理組，重復(fù)用PCR芯片測定3次。采用ΔΔCt方法比較相應(yīng)基因的表達量變化。表達量差異在2倍以上者為差異有意義基因。

1.2.5 蛋白表達檢測 采用Western blot法。提取各組細胞總蛋白，蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA）法測定蛋白濃度。取30μg蛋白質(zhì)，與5×上樣緩沖液混合，100℃變性10min。各種一抗以1∶1 000稀釋。加入ECL化學發(fā)光試劑，反應(yīng)5min，X線片曝光后，顯影，定影，以管家基因β-actin作為內(nèi)參照。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，細胞增殖及凋亡結(jié)果采用單因素方差（組間比較采用LSD法）分析，檢驗水準α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 細胞增殖結(jié)果 NaF（劑量分別為5、10、20、40、80mg／L）對人成骨細胞Saos-2作用24h后，細胞存活率分別為（100.678 5±2.830 3）%、（105.393 4±2.538 4）%、（106.125 7±2.048 4）%、（77.977 3±2.544 2）%、（30.237 7±0.632 7）%。與對照組比較，40、80mg／L組的細胞存活率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1。

2.2 流式細胞儀檢測凋亡結(jié)果 NaF可以促進Saos-2細胞凋亡，在5、10、20、40、80mg／L濃度下Saos-2細胞凋亡率分別為4.8%、13.8%、37.0%、58.9%、63.2%（P＜0.05），呈現(xiàn)出劑量依賴性，其濃度越高，促凋亡作用越強，見圖2。

2.3 PCR芯片檢測結(jié)果 PCR芯片檢測顯示在總共84個檢測基因中表達下調(diào)的有FBXO6基因，表達上調(diào)的有BIP、XBP1、ATF4、PERK、IRE1α、IRE1β、ERO1LB、JNK3、PDIA3、USP14、HSPA1L、HSPH1、HTRA4、UGCGL1等14個基因，圖3。

圖1 不同濃度NaF對人成骨肉瘤細胞Saos-2的增殖抑制作用

圖2 不同濃度NaF對人成骨肉瘤細胞Saos-2的凋亡作用

2.3 Western blot檢測結(jié)果 0、5、10、20、40、80mg／L NaF作用Saos-2細胞24h后抽提細胞總蛋白進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），分別行 EIF2Sα、ATF4、IRE1、GRP78、XBP1和CHOP蛋白檢測結(jié)果。BIP表達隨NaF劑量增高而增強；CHOP在40與80mg／L時表達，且逐漸增強；XBP1在5～10mg／L時，表達隨NaF劑量逐漸增強，在40與80mg／L時表達減弱；ATF4表達明顯隨NaF劑量增高而增強；IRE1也隨NaF干預(yù)劑量增高而表達增強，但不如ATF4明顯；EIF2a表達在各劑量組中基本保持不變，見圖4。

圖4 不同濃度NaF作用于人成骨細胞24h的蛋白表達

3 討 論

當細胞內(nèi)未折疊蛋白質(zhì)或錯誤折疊的蛋白質(zhì)聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，即可引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而進一步產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，表現(xiàn)為UPR，以恢復(fù)或維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能[4-5]。持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，如不能恢復(fù)，會導(dǎo)致細胞凋亡[6-7]。氟可以造成成骨細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并引起UPR，并調(diào)節(jié)成骨細胞的分化和成熟[8]。引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的途徑可能是氟離子引起的過氧化反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣代謝紊亂或者氟離子的直接化學作用[9-11]。

RT-PCR Array是目前較為簡單實用的檢測基因表達的方法，能夠一次性檢測84個與UPR相關(guān)的基因在mRNA水平上的表達，結(jié)果無需再進行實時熒光定量檢測。在本研究中，下調(diào)的基因FBXO6，與誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性降解（ER-associated degradation，ERAD）有關(guān)。在表達上調(diào)的14個基因中，屬于未折疊蛋白結(jié)合的基因有：UGCGL1、ERO1LB；屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)折疊的質(zhì)量控制的基因有：GANC；屬于翻譯調(diào)節(jié)的基因有：EIF2A；屬于ERAD的基因有：HTRA4；屬于泛素化有關(guān)的基因為USP14；屬于轉(zhuǎn)錄因子的有：ATF4、XBP1、IRE1α、IRE1β；屬于凋亡相關(guān)基因的有：JNK3、PERK；屬于熱休克蛋白的基因有：HSPA1L、HSPH1、BIP；屬于蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶的基因有：PDIA3。

從芯片檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)過量氟引起了成骨肉瘤細胞Saos-2未折疊蛋白信號通路中多種基因有意義表達，進一步用Western blot發(fā)現(xiàn)BIP、CHOP、XBP1、ATF4等蛋白表達隨劑量逐漸增高，ATF4、XBP1分別屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激3條通路中的兩條：PERK和IRE-1，說明這兩條通路均參與了氟對成骨細胞的作用。本研究中尚未發(fā)現(xiàn)第3條通路ATF6路徑在染氟過程中的變化。尤其是PTEN途徑，ATF4的蛋白表達呈現(xiàn)出典型的劑量反應(yīng)關(guān)系。XBP1在NaF 5～20mg／L表達逐漸增強，與此時成骨細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)增強有關(guān)。而在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激較強狀態(tài)時，40、80mg／L的表達減少，XBP1s蛋白表達受到抑制，可能是UPR受阻，進入誘導(dǎo)細胞凋亡[12]。而此時染氟成骨已經(jīng)不能處理UPR，成骨細胞逐漸轉(zhuǎn)向凋亡，這與流式細胞儀反映出的結(jié)果相符。CHOP的表達與凋亡密切相關(guān)，在芯片的檢測結(jié)果中雖然沒有發(fā)現(xiàn)其高表達，但是據(jù)已有的研究和本次實驗發(fā)現(xiàn)，在NaF 20、40mg／L時表達明顯增高，也與流式細胞儀的凋亡百分率結(jié)果相符合。

綜上所述，氟所激活的UPR信號通路與成骨細胞的生長和增殖密切相關(guān)。尤其是氟中毒條件下成骨細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與細胞凋亡存在一定的關(guān)系，本研究僅涉及少數(shù)凋亡相關(guān)基因，與凋亡信號通路尚未聯(lián)合研究，并且其發(fā)生的先后順序仍需要進一步研究。

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