30個(gè)祖先信息位點(diǎn)的篩選及應(yīng)用

李彩霞，賈竟，魏以梁，萬立華，胡蘭，葉健

1. 公安部物證鑒定中心，北京 100038；

2. 重慶醫(yī)科大學(xué)，重慶 400016；

3. 天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300070

祖先信息位點(diǎn)(Ancestry informative markers,AIMs)是指在不同人群之間基因頻率差異非常大的多態(tài)性基因位點(diǎn)[1]。單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms, SNPs)由于在基因組中數(shù)量多、分布廣，成為近年來篩選 AIMs位點(diǎn)、分析人群遺傳結(jié)構(gòu)的重要遺傳標(biāo)記之一[2,3]。一組祖先信息位點(diǎn)可以分析某一人群的遺傳成分構(gòu)成，也可以推斷某一個(gè)體的祖先來源[4]。這對于避免或降低遺傳學(xué)分析時(shí)由于人群分層現(xiàn)象導(dǎo)致的誤差具有重要意義，同時(shí)對于法醫(yī)學(xué)中推斷未知 DNA樣本的種族來源也具有重要意義。

不同的人群之間具有非常顯著的表型差異，如膚色、發(fā)色、虹膜顏色、體內(nèi)生化代謝等，這些表型的差異多與基因的多態(tài)性相關(guān)[5,6]。研究這些基因上頻率分布差異顯著的SNPs，通過評價(jià)族群間遺傳分化指數(shù)(Fixation index between subpopulation and total population,Fst)、δ值(人群兩兩之間的等位基因頻率的差值)等參數(shù)可獲得一組 AIMs，再通過STRUCTURE遺傳成分分析等可以實(shí)現(xiàn)人群遺傳結(jié)構(gòu)和個(gè)體的祖先來源推斷[7,8]。本研究針對東亞、歐洲和非洲人群的遺傳推斷，篩選了一組祖先信息位點(diǎn)，建立了一套有效的檢測和分析方法，以期分析DNA供者的祖先來源，為案件偵查提供線索。

1 材料和方法

1.1 研究對象

通過兩個(gè)途徑總共收集了14個(gè)人群的852份無關(guān)個(gè)體樣本：其中，5個(gè)人群的 194份無關(guān)個(gè)體樣本(3個(gè)人群124名無關(guān)個(gè)體外周靜脈血和干血片以及2個(gè)人群70名無關(guān)個(gè)體的DNA樣本)根據(jù)知情同意原則采集；9個(gè)人群的 658份無關(guān)個(gè)體的樣本信息由 HapMap數(shù)據(jù)庫下載并整理得到，根據(jù)數(shù)據(jù)庫信息以及文獻(xiàn)報(bào)道對出現(xiàn)三聯(lián)或二聯(lián)家系的人群樣本(ASW、CEU、MEX和YRI)進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾篩選(表1)。所有的采集樣本均有明確的人群來源信息。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

外周靜脈血 DNA根據(jù) QIAamp? DNA blood midi試劑盒(德國 Qiagen公司)提?。桓裳?DNA根據(jù)QIAamp? DNA Mini M48試劑盒(德國Qiagen公司)提取。所有提取的DNA經(jīng)過NanoDrop 2000c分光光度計(jì)(美國Thermo公司)定量。

1.2.2 AIMs位點(diǎn)選擇

用于位點(diǎn)篩選的東亞、歐洲、非洲人群來自HapMap數(shù)據(jù)庫，其中東亞人群包含150名個(gè)體(76名CHB和74名JPT)；歐洲人群包含174名個(gè)體(104名CEU和70名TSI)；非洲人群包含175名個(gè)體(77名LWK和98名YRI)。從30個(gè)表型相關(guān)基因(DCST1、SLC45A2、HMGCR、COL4A3BP、EGFR、CYP3A4、TYRP1、PDLIM1、TYR、DRD2、VDR、HMGA2、DCT、SLC24A4、OCA2、HERC2、HERC2P9、APBA2、SLC24A5、SLC12A1、MYO5C、CYP1A2、FANCA、MC1R、PRDM7、CSH1、ASIP、AHCY、TNFRSF13C和NAGA)上總共選取了282個(gè)SNP位點(diǎn)。這些基因與膚色、瞳孔顏色、黑色素代謝、免疫反應(yīng)、泛素化以及脂質(zhì)合成代謝等相關(guān)[5,6]。通過δ值、Fst值等原則評估并篩選這些 SNPs位點(diǎn)，具體包括：(1) 去除不符合哈迪溫伯格平衡的位點(diǎn)(P＜0.001)；(2) 人群特異性位點(diǎn)根據(jù)δ＞0.5進(jìn)行篩選；(3) 通過Genepop 4.2計(jì)算3個(gè)大洲人群的Fst值，根據(jù)值的大小排序，從大到小選擇位點(diǎn)，通過Structure軟件評價(jià)位點(diǎn)區(qū)分效果，目標(biāo)是通過最少的位點(diǎn)獲得最佳區(qū)分效果；(4) 通過Haploview 4.2 進(jìn)行位點(diǎn)體系的連鎖平衡評價(jià)，保證體系內(nèi)的位點(diǎn)處于連鎖平衡的狀態(tài)(r2＜0.1)。

1.2.3 AIMs位點(diǎn)區(qū)分效果評價(jià)

使用篩選到的 AIMs位點(diǎn)區(qū)分 HapMap數(shù)據(jù)庫人群，驗(yàn)證評價(jià)位點(diǎn)區(qū)分效果。共 9個(gè)人群的 658份無關(guān)個(gè)體的樣本信息(YRI、LWK、ASW、CEU、TSI、GIH、MEX、CHB、JPT)。使用 Structure 2.3.4進(jìn)行人群的聚類分析。使用Distruct 1.1繪制人群聚類結(jié)果圖。最后將聚類結(jié)果與 HapMap所提供的樣本來源信息進(jìn)行比較。使用Structure軟件進(jìn)行。

人群聚類分析時(shí)，首先取3人群模式(即參數(shù)K= 3時(shí))對人群的成分構(gòu)成進(jìn)行分析。隨后根據(jù)K值的增加，觀察所構(gòu)建體系是否能對研究人群進(jìn)行細(xì)分。

表1 人群樣本及其東亞、歐、非3大人群主成分構(gòu)成表

1.2.4 復(fù)合檢測體系構(gòu)建與樣本檢驗(yàn)

以GenomeLabTMSNPstream?基因分型系統(tǒng)(美國Beckman公司)構(gòu)建30-plex SNPs復(fù)合檢測體系。對收集的來自 5個(gè)人群的 194份樣本進(jìn)行分型檢測(Nigeria、Dane、Indian、Uyghur、Han)，隨機(jī)抽取其中的50份樣本進(jìn)行30個(gè)位點(diǎn)的測序(博奧生物有限公司)驗(yàn)證SNP分型結(jié)果的準(zhǔn)確性。所獲得的SNP分型用STRUCTURE軟件進(jìn)行人群的成分構(gòu)成進(jìn)行分析，具體方法同1.2.3所述，分析結(jié)果同樣本的已知來源進(jìn)行比對，驗(yàn)證人群區(qū)分的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 AIMs位點(diǎn)的篩選結(jié)果

從來自于30個(gè)基因上總共282個(gè)SNP位點(diǎn)中最終篩選出了 30個(gè) AIMs位點(diǎn)(表 2)，這組位點(diǎn)針對東亞、歐洲、非洲來源人群的具有顯著且平衡的區(qū)分能力。并且AIMs體系中每一個(gè)SNP位點(diǎn)的等位基因頻率在3個(gè)人群間具有較大差異。其中10個(gè)位點(diǎn)可用作區(qū)分東亞人群(即這些位點(diǎn)在非洲/東亞人群以及歐洲/東亞人群間具有較大的δ值，δ=0.652±0.096)；10個(gè)位點(diǎn)區(qū)分歐洲人群(即這些位點(diǎn)在非洲/歐洲人群以及東亞/歐洲人群間具有較大的δ值，δ=0.648±0.136)；10個(gè)位點(diǎn)區(qū)分非洲人群(即這些位點(diǎn)在非洲/歐洲人群以及東亞/歐洲人群間具有較大的δ值，δ=0.647±0.071)。

所有位點(diǎn)都符合哈迪溫伯格平衡(P＞ 0.01)，位點(diǎn)間連鎖平衡(r2＜ 0.1)，所有位點(diǎn)的Fst＞ 0.35。

表2 30個(gè)AIMs位點(diǎn)的信息

2.2 AIMs位點(diǎn)的評估

HapMap 數(shù)據(jù)庫中 9個(gè)人群的聚類結(jié)果如圖 1所示。從圖中可清楚的看出，9個(gè)人群在三人群模式(即參數(shù)K=3時(shí))下，被聚類成 3個(gè)大的群體，擁有兩個(gè)或3個(gè)群體成分的混合人群也可區(qū)分出來，即非洲人群(YRI和LWK)、歐洲人群(CEU和TSI)和東亞人群(CHB和 JPT)以及非洲和歐洲的混合人群(ASW)、非洲、歐洲、東亞的混合人群(GIH和MEX)。在四人群模式(即參數(shù)K=4時(shí))下，新的人群即 GIH以獨(dú)立結(jié)構(gòu)顯示出來，ASW、MEX人群仍以混合人群結(jié)構(gòu)形式顯示。若繼續(xù)增加K值，未觀察到新的人群以獨(dú)特成分顯示。

圖1 HapMap數(shù)據(jù)庫中9個(gè)人群聚類圖

2.3 體系構(gòu)建與樣本檢驗(yàn)結(jié)果

使用30-plex SNPs復(fù)合檢測體系，檢測5個(gè)人群(中國漢族、丹麥、尼日利亞、維吾爾族和印度)194份樣本分型，共獲得4762個(gè)SNP位點(diǎn)的分型，檢出率為99%，隨機(jī)抽取的50份樣本測序共獲得1487個(gè)SNP分型，所有測序分型結(jié)果與本研究構(gòu)建體系檢測結(jié)果一致。

結(jié)合HapMap的9個(gè)人群信息，將全部14個(gè)人群852份樣本聚類。所有14個(gè)人群在Structure軟件三人群模式(即參數(shù)K=3時(shí))下，都可以三大人群(東亞、歐、非)成分的組合形式表示出來，即每一人群都擁有某一種或幾種祖先來源成分。并且具有相同或相似祖先來源的群體，我們能觀察到其結(jié)構(gòu)的一致性。由表1可見，CHB、JPT、Han群體東亞成分人種主成分超過 0.95；CEU、TSI、Dane群體歐洲人種主成分超過0.97；YRI、LWK、Nigeria群體非洲人種主成分超過0.96，ASW群體中摻入歐洲人種成分；Uyghur群體為東亞人與歐洲人種成分混合；GIH、Indian、MEX以歐洲人種成分為主，少量摻入東亞人種與非洲人種成分(圖2)。圖3進(jìn)一步展示了所有14個(gè)人群的成分構(gòu)成情況。以K=3的聚類分析結(jié)果，我們將每一個(gè)人群的結(jié)構(gòu)用三大人群成分的百分比構(gòu)成表示。圖中所標(biāo)示的具體位置代表樣本采集地點(diǎn)。從圖中能清楚的看出，不同的人群擁有不同遺傳主成分，相似的人群或相同來源的人群其結(jié)構(gòu)具有相似性。當(dāng)K=4時(shí)，與HapMap的9人群驗(yàn)證時(shí)的結(jié)果相似，GIH和Indian以自己的獨(dú)特成分從其他人群中得以區(qū)分。若繼續(xù)增加K值，未觀察到新的人群以獨(dú)特成分顯示。通過上述分析獲得的所有樣本的種族結(jié)果與已知來源完全一致。

圖2 14個(gè)人群的聚類圖

圖3 14個(gè)人群的遺傳成分圖

3 討 論

本研究針對東亞、歐洲、非洲三大人種，共篩選出30個(gè)AIMs位點(diǎn)，構(gòu)建了復(fù)合SNP檢測體系。該體系可以有效進(jìn)行三大人群和混合人群遺傳結(jié)構(gòu)成分的區(qū)分。30個(gè)位點(diǎn)具有較高的信息含量(Fst＞0.35)，在所有研究人群中滿足哈迪溫伯格平衡及連鎖平衡；并且在三個(gè)大洲來源人群的推斷能力上具有平衡性(30個(gè)位點(diǎn)中，每10個(gè)位點(diǎn)為一組人群特異性位點(diǎn)，兩兩人群間的δ值＞0.5)。

不同人群之間的皮膚顏色、頭發(fā)顏色、虹膜顏色、代謝等特征存在較大的差異，而相關(guān)基因上的SNPs位點(diǎn)是導(dǎo)致這些差異的原因之一[5,6]。從這些基因上選擇人群之間等位基因頻率分布差異大的一組SNP位點(diǎn)可以進(jìn)行人群遺傳結(jié)構(gòu)成分的區(qū)分[1,4,9]。本研究從 30個(gè)表型相關(guān)基因上初篩到 282個(gè)差異SNP位點(diǎn)。在實(shí)際檢驗(yàn)中，位點(diǎn)過多會直接影響到檢測體系構(gòu)建的難度和體系的靈敏度，所以需進(jìn)一步篩選并減少位點(diǎn)，同時(shí)又能保持最佳的人群區(qū)分效能。根據(jù)1.2.1中所述原則，最后篩選出30個(gè)AIMs位點(diǎn)。其中一些位點(diǎn)具有非常顯著的人群特異性，例如，rs28777位于SLC45A2基因的內(nèi)含子區(qū)內(nèi)，等位基因A在歐洲人群中占主導(dǎo)，等位基因頻率為0.989，而其在非洲和東亞人群中的頻率分別為0.156和0.133。為了達(dá)到3個(gè)人群區(qū)分的均衡性，每個(gè)人群 AIMs位點(diǎn)的數(shù)量也保持一致，通過δ值將每一位點(diǎn)和三大人群的特征對應(yīng)起來，30個(gè)AIMs位點(diǎn)共分為 3組。以東亞特征的 AIMs位點(diǎn)為例，其具有較大的非洲/東亞δ值和歐洲/東亞δ值。例如：rs885479的非洲/東亞δ值、歐洲/東亞δ值和非洲/歐洲δ值分別為0.683、0.678和0.005，說明此位點(diǎn)在東亞與非、歐人群具有非常大的等位基因頻率分布差異，而在非、歐人群間的等位基因頻率差異很小。

對應(yīng)于人類學(xué)上人種分類的三分法，根據(jù)本課題的研究結(jié)果，某一人群的遺傳構(gòu)成可以東亞、歐、非三大人群成分所占的百分比表示；對于某一樣品的祖先信息推斷，可以用三大人群成分所占百分比來表示此樣品的遺傳成分構(gòu)成從而獲得其祖先來源信息。通過 HapMap人群樣本和實(shí)驗(yàn)樣本的分析可以看出，相同來源的人群呈現(xiàn)出遺傳結(jié)構(gòu)上的相似性，而混合人群具有混合的遺傳成分。Han、CHB、JPT的主成分是東亞黃種人，CEU、TSI、Dane的主成分是歐洲白人，YRI、Nigeria、LWK的遺傳主成分為非洲黑人。ASW是美國西南部非裔人群，雖然有一些歐洲白人成分，但其基本的構(gòu)成還是以非洲黑人成分為主。而 Uyghur、MEX、Indian、GIH則為明顯的混合人群，人群的遺傳主成分與其地理分布具有一致性(圖 3)。例如，從中國新疆收集的Uyghur人群的主成分是東亞和歐洲，同其位于歐亞大陸間的地理位置具有一致性。而位于南亞的印度人群樣本則呈現(xiàn)出了三大人群的成分都占有一定比例的情況。但相比之下，其歐洲和非洲人群的成分較維族人群要多一些，這些都符合印度人的膚色及面部等外貌特征。另外，印度人群能以獨(dú)立成分在K=4的時(shí)候顯示出來，這是一個(gè)人群細(xì)分的現(xiàn)象，說明印度人群在遺傳結(jié)構(gòu)上具有其特性，這一點(diǎn)從K=3時(shí)的印度人群結(jié)構(gòu)成分圖上就能得以體現(xiàn)。由此可見，本研究篩選的 AIMs位點(diǎn)可以有效的分析三大人群及混合人群的遺傳成分構(gòu)成。

本研究構(gòu)建的30-plex SNPs復(fù)合檢測體系是基于微測序-通用芯片技術(shù)構(gòu)建的，在本課題組前期研究中[10]，發(fā)現(xiàn)該技術(shù)方法在準(zhǔn)確性、靈敏度等方面能夠滿足研究需求。在本研究中，為確保分型結(jié)果準(zhǔn)確性，我們隨機(jī)抽取其中50份樣本進(jìn)行測序，結(jié)果表明體系檢測結(jié)果與測序結(jié)果完全一致。本研究的目的主要在于篩選一組 AIMs位點(diǎn)，并且建立一套祖先來源推斷的方法體系，所以在體系構(gòu)建方面并沒有做更進(jìn)一步的優(yōu)化。檢測結(jié)果表明，所篩選的位點(diǎn)和建立的區(qū)分方法體系，能夠很好的實(shí)現(xiàn)三大人群和混合人群遺傳成分的分析。但是，現(xiàn)有檢測體系的檢測時(shí)間較長，需要10 h左右，而且需要專用的芯片檢測裝置和耗材，不利于廣泛應(yīng)用，在下一步研究中，我們將針對實(shí)際應(yīng)用，建立更簡便的適合毛細(xì)管電泳儀檢測的復(fù)合體系。另外，本文篩選位點(diǎn)主要是針對洲際人群及其混合人群區(qū)分的，從法醫(yī)學(xué)應(yīng)用角度，該體系能夠用于日益增多的涉外案件中個(gè)體祖先來源的推斷。但是對于更多案件檢驗(yàn)的需求，還不能完全滿足遺傳連鎖分析中由于人群分層現(xiàn)象導(dǎo)致誤差的有效控制，更進(jìn)一步的亞人群的區(qū)分需要繼續(xù)進(jìn)行研究，例如東亞人群、中國南北方人群等。國內(nèi)學(xué)者的相關(guān)報(bào)道[11～13]為下一步亞人群的區(qū)分研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

總之，本研究建立了30個(gè)AIMs位點(diǎn)的復(fù)合體系，該體系可以有效進(jìn)行東亞、歐洲、非洲三大人群和混合人群的遺傳主成分分析和個(gè)體的人種來源推斷，相關(guān)方法可以用于法醫(yī)DNA檢驗(yàn)中未知樣本的祖先來源推斷，為案件提供更多偵查線索。

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