免疫相關(guān)的巨噬細(xì)胞和髓樣血管生成細(xì)胞在視網(wǎng)膜新生血管發(fā)生發(fā)展中的作用△

高翔 王雨生

視網(wǎng)膜新生血管(retinal neovascularization，RNV)是許多致盲性眼病共有的病理學(xué)特征，如早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、糖尿病視網(wǎng)膜病變和視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞等。RNV的發(fā)病機(jī)制與內(nèi)層視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞死亡、毛細(xì)血管阻塞引起的缺血、缺氧密切相關(guān)。缺血、缺氧可刺激視網(wǎng)膜細(xì)胞高表達(dá)促血管形成細(xì)胞因子，活化血管內(nèi)皮細(xì)胞，使其從原有血管中增生、移行而形成新的血管網(wǎng)，這一過(guò)程即血管生成［1-2］。但新生血管是由異常細(xì)胞成分構(gòu)成的，不易建立健康的血-視網(wǎng)膜屏障，易滲漏或破裂，導(dǎo)致視網(wǎng)膜水腫、出血和滲出。RNV存在于視網(wǎng)膜表層，可向玻璃體延伸生長(zhǎng)，不斷發(fā)展必將威脅患者的視功能，因此深入探究RNV發(fā)病機(jī)制十分必要。近年來(lái)研究提示，免疫相關(guān)巨噬細(xì)胞(macrophages，MΦ)和髓樣血管生成細(xì)胞(myeloid angiogenic cells，MACs)在RNV發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。

1 MΦ在RNV發(fā)生發(fā)展中的作用

MΦ是固有免疫和獲得性免疫反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，是宿主防御的第一道防線。除了這些眾所周知的功能外，MΦ在維持機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面也發(fā)揮著重要作用，其可參與組織創(chuàng)傷修復(fù)、組織重建、血管形成和凋亡等［3］。

在氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變(oxygen-induced retinopathy，OIR)模型中發(fā)現(xiàn)，RNV的形成需要血液-骨髓中的MΦ參與［4-5］。研究觀察到，小鼠OIR模型中玻璃體和視網(wǎng)膜MΦ數(shù)目顯著增加［6-7］。采用免疫熒光法證實(shí)，小鼠OIR模型中的 MΦ和小膠質(zhì)細(xì)胞定位在視網(wǎng)膜前的新生血管簇中［4，8-10］，且 F4/80(+)MΦ數(shù)目在生后17 d(P17)到P21(即RNV數(shù)目最多)時(shí)達(dá)到高峰［4］。相反，巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)是單核系細(xì)胞向成熟MΦ分化所需要的重要細(xì)胞因子。當(dāng)缺乏M-CSF時(shí)，OIR中 RNV減少［7］。這些結(jié)果表明，活化的MΦ向視網(wǎng)膜募集參與了病理性RNV發(fā)生。然而，詳細(xì)機(jī)制還尚未明確。

1.1 MΦ的來(lái)源 一般認(rèn)為，MΦ源于造血干細(xì)胞。造血干細(xì)胞在骨髓微環(huán)境中可分化為髓樣祖細(xì)胞和淋巴樣祖細(xì)胞。前者進(jìn)一步分化為單核細(xì)胞，同樣也是粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板、樹(shù)突細(xì)胞和肥大細(xì)胞的共同前體細(xì)胞。分化而來(lái)的單核細(xì)胞隨后從骨髓中釋放入血液循環(huán)。血液中的單核細(xì)胞部分可移行到組織中成為定居的MΦ，后者根據(jù)其所定居的組織微環(huán)境獲得特異性免疫表型，具有不同的形態(tài)和功能特征，如骨組織中的破骨細(xì)胞、肝臟中的Kupffer細(xì)胞、肺臟中的肺泡巨噬細(xì)胞等［11］。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中定居的MΦ即為小膠質(zhì)細(xì)胞。關(guān)于小膠質(zhì)細(xì)胞的來(lái)源說(shuō)法不一，起初認(rèn)為源于骨髓，最新研究表明其來(lái)源于早期發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)的胚胎卵黃囊中的祖細(xì)胞。這些祖細(xì)胞會(huì)發(fā)育成大腦，并產(chǎn)生小膠質(zhì)細(xì)胞，維持到成年［12］。

參與RNV的MΦ多是從血液中募集而來(lái)的。在OIR模型中的RNV達(dá)到峰值時(shí)，并未觀察到視網(wǎng)膜局部小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，表明隨RNV出現(xiàn)而增多的F4/80(+)細(xì)胞是由血液中單核細(xì)胞/MΦ向視網(wǎng)膜組織浸潤(rùn)而形成的［4］。

1.2 MΦ的募集 循環(huán)中的單核細(xì)胞/MΦ向RNV處募集并促進(jìn)其形成的具體機(jī)制還尚不清楚，可能與多種因子密切相關(guān)。

1.2.1 單核細(xì)胞趨化蛋白-1 Davies等［4］觀察到，在小鼠OIR模型中，當(dāng)P17～21的RNV達(dá)到峰值時(shí)，F(xiàn)4/80(+)MΦ數(shù)目也達(dá)到高峰，同時(shí)可見(jiàn)P17時(shí)單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoat-tractant protein-1，MCP-1)顯著增加。使用 MCP-1缺失(MCP-1-/-)小鼠建立OIR模型觀察到，與野生型對(duì)照相比，P17時(shí)RNV簇相關(guān)的F4/80(+)細(xì)胞數(shù)目明顯減少，視網(wǎng)膜 F4/80 mRNA表達(dá)明顯下降［13］。提示MCP-1可以趨化MΦ參與RNV形成。

1.2.2 基質(zhì)金屬蛋白酶-12 基質(zhì)金屬蛋白酶-12(matrix metalloproteinase-12，MMP-12)可以募集 MΦ參與血管形成。MMP-12亦稱巨噬細(xì)胞金屬?gòu)椥缘鞍酌?，是一種由炎性MΦ表達(dá)和分泌的彈性蛋白酶。在一項(xiàng)關(guān)于吸煙誘導(dǎo)肺氣腫的研究中使用MMP-12缺陷小鼠發(fā)現(xiàn)，向肺臟浸潤(rùn)的 MΦ數(shù)目明顯減少［14］。在關(guān)于皮膚肉芽腫和炎性關(guān)節(jié)炎的研究中表明，MMP-12過(guò)表達(dá)與MΦ移行增多有關(guān)［15-17］。說(shuō)明在炎癥反應(yīng)中，MMP-12對(duì)MΦ的移行和募集發(fā)揮重要作用。

有研究表明，在小鼠OIR模型中MMP-12表達(dá)上升，伴隨著MΦ浸潤(rùn)增加和炎性標(biāo)志物水平增加。用MMP-12基因敲除小鼠構(gòu)建OIR模型，視網(wǎng)膜毛細(xì)血管阻塞減輕、病理性RNV減少，同時(shí)視網(wǎng)膜MΦ數(shù)目也減少、MΦ移行能力受損，伴隨著黏附分子和炎性細(xì)胞因子水平下降、血管滲漏減少。使用MMP-12的藥物拮抗劑 MMP408時(shí)，也觀察到相似的結(jié)果［18］。這些結(jié)果表明，MMP-12是MΦ向視網(wǎng)膜浸潤(rùn)和炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其在視網(wǎng)膜RNV形成中發(fā)揮重要作用。

1.3 不同的MΦ極化亞型對(duì)RNV的影響 募集到視網(wǎng)膜的MΦ可發(fā)揮非常廣泛的生物學(xué)作用，包括參與RNV形成［19］。MΦ依靠其極化發(fā)揮促血管形成和抗血管形成的雙重功能，而極化受其定居組織微環(huán)境所產(chǎn)生的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)［20-23］。在干擾素γ(interferon gamma，IFN-γ)、脂多糖或粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子刺激下，MΦ可產(chǎn)生高水平的IL-12、IL-23、IL-6和 TNF-α，低水平的 IL-10。這種“經(jīng)典活化”的MΦ即M1型MΦ，表現(xiàn)出抗血管形成表型，并在抗菌和促炎方面發(fā)揮重要作用。另一方面，MΦ在IL-10、IL-4或IL-13刺激下，可產(chǎn)生高水平的IL-10和低水平的促炎細(xì)胞因子，如IL-6和TNF-α。這種“替代活化”的MΦ即M2型MΦ，具有促血管形成功能。根據(jù)極化后的功能，可將MΦ進(jìn)一步分為不同功能的細(xì)胞亞型，即負(fù)責(zé)宿主防御的M1型、負(fù)責(zé)損失愈合的M2a型、負(fù)責(zé)免疫調(diào)節(jié)的M2b型以及負(fù)責(zé)組織重建調(diào)節(jié)的M2c型MΦ［24］。

盡管M1和M2型極化代表了兩個(gè)極端，但MΦ可被活化成為這兩種極端之間的任何一種表型。有研究證實(shí)，MΦ在這些活化狀態(tài)之中是具有彈性的，可從一種活化狀態(tài)快速轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N活化狀態(tài)，且在具有相反作用的細(xì)胞因子刺激下，其活化狀態(tài)的轉(zhuǎn)變是完全可逆的［25-26］。

近來(lái)Marchetti等［27］將體外培養(yǎng)的M1和M2型MΦ，于小鼠P7時(shí)經(jīng)玻璃體進(jìn)行注射，之后構(gòu)建OIR模型，于P17時(shí)行視網(wǎng)膜鋪片、Lectin染色觀察，結(jié)果表明M1型MΦ可使無(wú)血管區(qū)面積減少約75%，而不影響RNV區(qū)面積;而M2型MΦ則不僅可以使無(wú)血管區(qū)面積減少約96%，且可同時(shí)抑制RNV區(qū)面積，使其減少約59%。此研究表明，不同極化狀態(tài)的MΦ對(duì)RNV的影響是不同的。如果可以使MΦ都向M2型極化，則可明顯減輕小鼠OIR病變，或許是治療RNV性疾病的新契機(jī)。

一是立志“成一家之言”。在年輕的時(shí)候，章學(xué)誠(chéng)就立下大志，要對(duì)《漢書(shū)·藝文志》進(jìn)行研究，校讎其書(shū)，申明微旨，“又取古今載籍，自六藝以降，訖于近代作者之林，為之商榷利病，討論得失，擬為《文史通義》一書(shū)，分內(nèi)外雜篇，成一家言”[1]。章學(xué)誠(chéng)的“成一家之言”是要對(duì)歷史文獻(xiàn)“商榷利病，討論得失”，發(fā)現(xiàn)規(guī)律，提出新的史學(xué)觀點(diǎn)，研究新的史學(xué)理論。章學(xué)誠(chéng)的學(xué)術(shù)實(shí)踐也正是這么做的，他在史學(xué)領(lǐng)域大膽發(fā)揮，“自信發(fā)凡起例，多為后世開(kāi)山?！盵2]為千古史學(xué)開(kāi)辟了新的道路。

1.4 IL-10在MΦ極化亞型轉(zhuǎn)化中的作用 IL-10

是在眼部對(duì)MΦ極化及其血管形成能力調(diào)節(jié)方面最有影響的細(xì)胞因子之一［20，28］。在小鼠脈絡(luò)膜新生血管模型中，IL-10可通過(guò)阻止MΦ向脈絡(luò)膜浸潤(rùn)而促進(jìn)新生血管生成［28］。另一觀點(diǎn)認(rèn)為，隨著年齡增長(zhǎng)，IL-10在眼部的基因表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致在衰老組織中脈絡(luò)膜新生血管增多，其原因是IL-10可將MΦ極化向促血管形成的表型［20］。

Dace等［29］研究證實(shí)，敲除 IL-10(IL-10-/-)會(huì)抑制小鼠病理性RNV。視網(wǎng)膜鋪片-免疫熒光染色結(jié)果表明，IL-10并不影響F4/80(+)MΦ向缺血視網(wǎng)膜的浸潤(rùn)，而IL-10將MΦ極化成具有促血管形成功能的表型可能是主要原因。RT-PCR結(jié)果表明IL-10-/-視網(wǎng)膜MΦ所產(chǎn)生的NOS2基因表達(dá)減少，即IL-10-/-MΦ產(chǎn)生的促血管形成的NO減少;且在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在缺氧條件下培養(yǎng)的IL-10-/-MΦ可有效抑制人表皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，減少VEGF基因表達(dá)。說(shuō)明缺氧可通過(guò)IL-10通路使MΦ極化向促血管形成的表型。

IL-10可促進(jìn)MΦ向M2表型極化。一項(xiàng)研究將IL-10與MΦ共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期(7 d)用IL-10培養(yǎng)MΦ可有效抑制經(jīng)典活化的MΦ(M1型)，而使替代活化MΦ(M2型)標(biāo)志物表達(dá)增加［30］。另一項(xiàng)研究也顯示外源性IL-10可抑制M1型MΦ表型，可顯著減少M(fèi)1型MΦ特征性的亞硝酸鹽和IL-6的產(chǎn)生，并抑制其介導(dǎo)的VEGF的產(chǎn)生，但未減少M(fèi)2型MΦ分泌 VEGF［31］。

1.5 MΦ對(duì)RNV的多重作用 不論定居在視網(wǎng)膜上，還是從遠(yuǎn)處募集而來(lái)，活化的MΦ在RNV發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著多重作用［32］。MΦ不僅在RNV形成中起作用，對(duì)RNV的退化也有影響。已有研究證實(shí)，活化的 MΦ可通過(guò)細(xì)胞表面 FasL、TNF-α和TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［33-38］。使用 MCP-1 缺失(MCP-1-/-)小鼠建立OIR模型后發(fā)現(xiàn)，在P17時(shí)血管簇相關(guān)的F4/80+MΦ數(shù)目顯著下降，但視網(wǎng)膜前RNV內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)目無(wú)明顯變化;在P21和P24時(shí)，MCP-1-/-小鼠視網(wǎng)膜前 RNV內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)目顯著增加［13］。說(shuō)明MCP-1-/-小鼠RNV簇相關(guān)MΦ減少，與RNV內(nèi)皮細(xì)胞凋亡減少及RNV退化延遲密切相關(guān)，提示MΦ可通過(guò)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡而使RNV退化。

2 MACs在視網(wǎng)膜血管形成中的作用

2.1 內(nèi)皮祖細(xì)胞的概念和分型 內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)的定義存在爭(zhēng)議［39］，特別是以EPCs為基礎(chǔ)的臨床研究常常使用錯(cuò)誤定義、成分不同的細(xì)胞。目前EPCs定義為血液循環(huán)中可參與血管形成的細(xì)胞。盡管這個(gè)定義范圍極廣泛，包括了多種細(xì)胞類型［40-41］，但目前仍沿用此定義。已有證據(jù)表明，EPCs可促進(jìn)缺血組織和腫瘤組織再血管化［42-43］。

2.2 MACs對(duì)血管形成的影響 MACs可通過(guò)旁分泌方式促進(jìn)視網(wǎng)膜血管形成。將MACs與視網(wǎng)膜毛細(xì)血管來(lái)源的微血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)后，MACs不直接參與構(gòu)建微血管網(wǎng)，但通過(guò)旁分泌方式釋放促血管形成因子，從而可增加血管樣結(jié)構(gòu)的形成。在小鼠OIR模型P12時(shí)玻璃體注射紅色Qdot標(biāo)記的MACs后，于P15時(shí)行視網(wǎng)膜鋪片觀察到，注射的MACs沒(méi)有整合到局部血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)中，但其可誘導(dǎo)血管形成和視網(wǎng)膜無(wú)血管區(qū)再灌注，使無(wú)血管區(qū)面積減少約 67%［48］。

不論是分子表型，還是抗炎、促血管形成等功能特性，MACs都與替代活化的M2型MΦ很相似［49］。有人證實(shí)MACs可作為替代活化的M2型MΦ，通過(guò)IL-8發(fā)揮促血管形成、抗炎和促組織修復(fù)的功能。RT-PCR分析表明MACs高表達(dá)M2型MΦ標(biāo)記物(MSR1、MRC1、IL-10、TGFβ2、CD163 等)及促血管形成基因(VEGFβ、CTGF、PDGFβ、MMP-9 等)，同時(shí)低表達(dá) M1 型 MΦ 標(biāo)記物(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12等)。MACs介導(dǎo)的促血管形成作用高度依賴于其所分泌的IL-8，而非VEGF。已證實(shí)MACs來(lái)源的IL-8可獨(dú)立于細(xì)胞外VEGF而活化VEGFR2［48］。

綜上，MACs可作為替代活化的M2型MΦ，通過(guò)旁分泌IL-8的方式發(fā)揮促視網(wǎng)膜血管形成功能的結(jié)論得到證實(shí)。

3 小結(jié)

RNV發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多細(xì)胞參與、多因子調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程，MΦ和MACs在其中發(fā)揮著重要作用。深入探究免疫相關(guān)因素在RNV這一病理過(guò)程中的作用機(jī)制，進(jìn)而開(kāi)展靶向治療的研究，將可能有助于改善RNV相關(guān)疾病的治療現(xiàn)狀。

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