無錫地區(qū)漢族人群RAGE基因啟動子區(qū)-374T/A多態(tài)性與糖尿病視網(wǎng)膜病變的相關研究△

顧喆瑤 姚勇 謝田華 曹葭 鄒健

無錫地區(qū)漢族人群RAGE基因啟動子區(qū)-374T/A多態(tài)性與糖尿病視網(wǎng)膜病變的相關研究△

顧喆瑤 姚勇 謝田華 曹葭 鄒健

晚期糖基化終末產(chǎn)物受體；基因多態(tài)性；糖尿病視網(wǎng)膜病變

目的探討無錫地區(qū)漢族人群RAGE基因啟動子區(qū)-374T/A多態(tài)性與糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetes retinopathy,DR)的相關性。方法運用聚合酶鏈反應直接測序法檢測120名正常人及185名2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者，包括DR患者92例，無糖尿病視網(wǎng)膜病變(non-diabetes retinopathy,NDR)患者93例的基因型。比較各組受檢者基因型和基因頻率及生化指標。結果DR組患者糖尿病病程明顯長于NDR組(t=2.254,P=0.01)，兩組間其他臨床特征的差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05);DR組、NDR組及對照組AA基因型頻率為6.5%、2.2%、3.3%，A等位基因頻率分別是23.9%、14.0%、15.4%；DR組AA基因型及A等位基因頻率分布顯著高于NDR組及對照組，其差異有統(tǒng)計學意義(P=0.026、P=0.015；P=0.035、P=0.027)。NDR組與對照組的各基因型和等位基因頻率分布比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。單因素Logistic回歸分析示，A等位基因是T2DM人群DR發(fā)病的危險因素(OR=1.934，95%CI:1.132～3.303)。結論RAGE基因啟動子區(qū)-374T/A多態(tài)性與無錫地區(qū)DR的發(fā)生有一定的相關性，且A等位基因可能是其危險因素。

[眼科新進展，2014，34(7):655-657，661]

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者最主要的致盲因素，其發(fā)生不僅和血糖控制、病程等因素有關，遺傳因素也起到了一定的作用。大量實驗表明，長期高血糖可激活晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)及其受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)信號轉導通路，誘導細胞內氧化應激，促進視網(wǎng)膜微血管生成，是導致DR的重要原因之一[1]。RAGE作為AGEs發(fā)揮生物活性的關鍵受體，其基因表達異常或活性改變，勢必影響DR的發(fā)生。目前已發(fā)現(xiàn)許多RAGE基因多態(tài)性，但這些基因多態(tài)性與DR的相關性研究結果仍存在爭議[2-4]。本文主要探討無錫地區(qū)漢族人群RAGE基因啟動子區(qū)-374T/A多態(tài)性與DR的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料收集無錫地區(qū)明確診斷的T2DM患者(按1999年WHO制定的診斷標準)185例作為研究對象，其中男91例，女94例，年齡(62.72±8.22)歲；入選標準:無錫地區(qū)漢族人群，個體間無親緣關系；年齡≥50周歲，病程≥10 a，并排除DR以外眼部疾病。對所有患者檢測眼壓、視力，并行裂隙燈顯微鏡、眼底檢查及熒光素眼底血管造影(fluorescein fundus angiography,FFA)。根據(jù)2002年DR國際臨床分型標準，將T2DM患者分為無糖尿病視網(wǎng)膜病變(non-diabetes retinopathy,NDR)組和DR組。DR組患者92例，男45例，女47例，年齡(63.60±7.23)歲；NDR組患者93例，男46例，女47例，年齡(61.85±9.06)歲；對照組為年齡、性別、地區(qū)與病例組相匹配的120名健康者，男61人，女59人，年齡(61.35±9.20)歲，均來自無錫市人民醫(yī)院體檢中心。記錄所有受檢人員的姓名、性別、年齡以及空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)、甘油三酯、總膽固醇(total cholesterol，TC)等生化指標。本研究經(jīng)江蘇省南京醫(yī)科大學倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2聚合酶鏈反應-直接測序分析方法

1.2.1基因組DNA提取抽取所有受檢人員外周靜脈血3 mL,體積分數(shù)2%EDTA抗凝，采用DNA提取試劑盒(Promega公司)提取基因組DNA，所提DNA均使用紫外分光光度儀檢測純度和含量。

1.2.2體外目的基因擴增引物設計參考文獻[5],擴增片段為RAGE基因啟動子區(qū)包括-374位點在內的250個堿基對。上游引物:5’-GGGGCAGTTCTCTCCTCACT-3’，下游引物:5’-GGTTCAGGCCAGACTGTTGT-3’，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應體系25 μL:2×GoldStar Taq Master Mix酶(北京康為世紀生物科技有限公司)12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA 0.5 μL，滅菌雙蒸水10 μL；反應條件:95 ℃初步變性5 min，30個循環(huán)周期后冷卻至4 ℃，每個循環(huán)包括:95 ℃變性45 s，67 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s。PCR產(chǎn)物經(jīng)20 μg·L-1溴化乙啶染色，20 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳，并在紫外凝膠系統(tǒng)成像下檢測后測序，測序由上海生工生物工程有限公司完成。

2 結果

2.1DR組與NDR組基本臨床資料分析DR組的病程為(14.22±4.22)a，明顯長于NDR組的病程(12.78±3.40)a(t=2.254,P=0.01)；兩組間收縮壓(systoic blood pressure，SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure,DBP)、FPG、TC、糖化血紅蛋白(hemoglobin A1c，HbA1c)、甘油三酯、體質量指數(shù)(body mass index，BMI)的差異均無統(tǒng)計學意義，一般臨床資料詳見表1。

2.2各組RAGE多態(tài)性比較各組基因型和基因頻率詳見表2。

測序結果顯示:試驗組和對照組人群的RAGE基因啟動子區(qū)-374位點均存在A、T兩種等位基因及AA、AT、TT三種基因型(圖1-圖2)，其基因型分布經(jīng)χ2檢驗均符合HWE 平衡(均為P>0.05)，說明本次研究人群具有很好的群體代表性。表2顯示了各組間RAGE-374位點基因型及基因頻率分布結果，其中DR組、NDR組及對照組AA基因型頻率為6.5%、2.2%、3.3%，A等位基因頻率分別是23.9%、14.0%、15.4%，DR組AA基因型及A等位基因頻率分布顯著高于NDR組(χ2=4.985，P=0.026；χ2=5.951，P=0.015)及對照組(χ2=4.455，P=0.035；χ2=4.865，P=0.027)，而TT基因型及T等位基因頻率分布明顯降低，其差異有統(tǒng)計學意義。NDR組與對照組的各基因型和等位基因頻率分布比較，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.077，P=0.782；χ2=0.172，P=0.678)。單因素Logistic回歸分析結果顯示:RAGE基因啟動子區(qū)-374多態(tài)性位點攜帶A等位基因T2DM人群的DR發(fā)病風險是攜帶T等位基因的1.934倍(OR=1.934，95%CI:1.132～3.303)。

表1 DR組與NDR組一般臨床資料分析Table 1 Comparison of demographics characteristics between DR group and NDR group(±s)

表2 各組間RAGE-374位點基因型及基因頻率分布比較Table 2 Distribution of RAGE -374T/A genotype and allele frequency(n，rate/%)

Figure 1 PCR amplification products electrophoresis results of RAGE -374T/A.M:Marker;1-6:Target bands RAGE基因-374位點PCR擴增產(chǎn)物電泳結果。M:Maker;1～6:目的條帶

Figure 2 Sequencing results of PCR amplification products of RAGE -374T/A.Inside of the box was the target genotype(-374) TA(A),AA(B),TT(C) RAGE基因-374位點擴增產(chǎn)物測序圖，圖中方框內為-374位點的基因型，從左到右依次顯示為TA型(A)、AA型(B)、TT型(C)

3 討論

Klein等[6]對威斯康新州關于DR的影響因素流行病學調查顯示，DR的發(fā)生與T2DM的病程呈正相關，病程在5 a以內的T2DM患者，其DR的患病率為28.8%，而病程超過15 a者，DR患病率為77.8%。本實驗結果也顯示，DR患者的病程顯著長于NDR組。

DR是T2DM主要的慢性并發(fā)癥之一，近年來研究發(fā)現(xiàn)DR的發(fā)生發(fā)展不僅與病程、血糖控制不佳有關，還與遺傳因素[7]及AGEs-RAGE信號轉導途徑[8]有關。大量研究發(fā)現(xiàn)，無論在T2DM動物模型，還是T2DM患者組織內如視網(wǎng)膜、腎小球系膜等AGEs積聚區(qū)域中，RAGE均處于高表達水平[9]。Kaji等[10]將RAGE注射到含RAGE的糖尿病小鼠腹腔內，可阻斷RAGE和AGEs的結合，降低血-視網(wǎng)膜屏障破壞，進而改善糖尿病小鼠視網(wǎng)膜病變程度，間接證實了RAGE在DR發(fā)生中起著關鍵作用。綜上所述，RAGE基因的表達在 DR病因學中起著重要作用。RAGE作為AGEs發(fā)揮病理效應的關鍵受體，其活性受到多因素的影響，除高血糖以外，RAGE基因變異及表達異常可能也是重要原因。2001年Husdon等[11]首次發(fā)現(xiàn)RAGE啟動子區(qū)存在-374T/A、-429T/C多態(tài)，并提出這兩位點的多態(tài)性能明顯增強該基因的轉錄活性。Abdel-Azeez等[12]研究也證實RAGE啟動子區(qū)-374T/A的置換可提高一系列轉錄因子對RAGE基因啟動區(qū)的親和力，誘導轉錄因子結合形成復合體，顯著影響其轉錄活性。

本研究發(fā)現(xiàn)，RAGE基因啟動子區(qū)-374T/A多態(tài)性中，DR組AA基因型及A等位基因頻率分布顯著高于NDR組及對照組，其差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；NDR組與對照組的各基因型及等位基因頻率分布比較，差異均無統(tǒng)計學意義，從而提示-374位點A等位基因可能是促進DR發(fā)生和進展的因子，而并非是導致T2DM發(fā)生和發(fā)展的因素。通過單因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，攜帶A等位基因T2DM人群的DR發(fā)病風險是攜帶T等位基因的1.934倍。因此我們推測:RAGE啟動子區(qū)-374T/A多態(tài)性與無錫地區(qū)DR的發(fā)生有一定相關性，且A等位基因可能是其危險因素。Lindholm等[3]的研究也證實，-374A等位基因能增加DR發(fā)生的風險，與本實驗的觀點相一致。但與Globocnik等[4]研究結論不同，這可能與研究人群的地域性、種族、樣本量以及病程等因素有關。

DR的發(fā)生發(fā)展受到多種因素的影響，其研究方法仍有一定的局限性，對于RAGE基因啟動子區(qū)-374T/A多態(tài)性與DR的確切關系，還需擴大樣本進一步前瞻性研究。以后我們將進一步研究該基因型與RAGE表達之間的關系，為DR臨床的早期診斷和基因治療打下基礎。

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date:Jul 25,2013

The Open Project Program of the Jiangsu Key Medical Laboratory(No:WKF0811)From theDepartmentofOphthalmology,WuxiPeople’sHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Wuxi214023，JiangsuProvince，China

Association analysis of advanced glycation end products gene receptor-374T/A polymorphisms in Han people of Wuxi area with type 2 diabetic retinopathy

GU Zhe-Yao,YAO Yong,XIE Tian-Hua,CAO Jia,ZOU Jian

advanced glycation end products receptor;gene polymorphism;diabetic retinopathy

ObjectiveTo investigate the correlation of advanced glycation end products (RAGE) receptor -374T/A gene polymorphism with diabetic retinopathy (DR) in type 2 diabetes mellitus.MethodsThe -374T/A polymorphism of RAGE gene was determined by polymerase chain reaction and direct sequencing in 120 normal control subjects and 185 patients with type 2 diabetes mellitus,including 92 subjects with DR and 93 subjects with NDR ( Non-DR).The frequencies of RAGE genotype,allele and biochemical criterion among those groups were compared.ResultsThe disease course in DR group was significantly longer than that in NDR group(t=2.254,P=0.01),and other biochemical criterion in both groups were not significant different(allP>0.05).In DR,NDR and normal control groups,the AA genotype frequencies were 6.5%,2.2% and 3.3%,respectively.The frequencies of A allele were 23.9%,14.0% and 15.4%,respectively.The DR group were higher than the NDR group and normal control group,there were statistical significant differences (P=0.026,0.015,0.035,0.027).The AA genotype frequencies and A allele frequencies between NDR group and normal control group showed no significant difference (allP>0.05).Single factor Logistic regression analysis showed A allele was associated with DR(OR=1.934,95%CI:1.132-3.303).ConclusionRAGE -374T/A gene polymorphism may be associated with the development of DR and the A allele may be the risk factor in Wuxi area.

顧喆瑤，女，1989年1月出生，江蘇人，碩士。主要研究方向為糖尿病視網(wǎng)膜病變。E-mail:1181992191@qq.com

AboutGUZhe-Yao:Female,born in January,1989.Postgraduate student.E-mail:1181992191@qq.com

2013-07-25

江蘇省醫(yī)學重點學科(實驗室)開放課題(編號:WKF0811)

214023 江蘇省無錫市，南京醫(yī)科大學附屬無錫市人民醫(yī)院 眼科

姚勇，E-mail:pard1@126.com

顧喆瑤，姚勇，謝田華，曹葭，鄒?。疅o錫地區(qū)漢族人群RAGE基因啟動子區(qū)?374T/A多態(tài)性與糖尿病視網(wǎng)膜病變的相關研究[J]．眼科新進展，2014，34(7)：655?657，661．

10．13389/j．cnki．rao．2014．0179

【應用研究】

修回日期:2014-02-21

本文編輯:董建軍

Accepteddate:Feb 21,2014

Responsibleauthor:YAO Yong，E-mail:pard1@126.com

[RecAdvOphthalmol，2014，34(7):655-657，661]