Nrf2信號(hào)通路及其在肝組織中的作用

何茂群，曹智華，苗得足*

（1.瑞陽(yáng)制藥有限公司，山東 沂源 256100；2.武漢諾貝藥業(yè)有限公司，湖北 武漢 430040）

外源性化合物進(jìn)入機(jī)體后，經(jīng)生物代謝轉(zhuǎn)化，可能形成活性代謝物而引起機(jī)體化學(xué)/氧化應(yīng)激的發(fā)生發(fā)展。轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2（Nrf2）是細(xì)胞防御這些應(yīng)激的重要調(diào)節(jié)因子，可通過調(diào)節(jié)許多細(xì)胞保護(hù)性基因的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞的毒性損傷起保護(hù)作用。

1 Nrf2信號(hào)通路

1.1 主要調(diào)控因子

1.1.1 Nrf2 Nrf2屬于帽和領(lǐng)（Cap'n'Collar，CNC）轉(zhuǎn)錄因子家族成員，是一個(gè)由2.2 kb的堿基對(duì)編碼的相對(duì)分子質(zhì)量為66 000的蛋白，其C末端是含7個(gè)亮氨酸重復(fù)序列的一條高度保守的堿性亮氨酸拉鏈（bZIP），bZIP結(jié)構(gòu)有助于其二聚化和與DNA結(jié)合，特別是與抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element, ARE）結(jié)合[1]。ARE是機(jī)體內(nèi)一個(gè)重要的順式作用元件，存在于Nrf2下游基因的啟動(dòng)子區(qū)域，其核心序列5'-GTGACnnnGC-3'可被許多氧化性和親電子物質(zhì)激活轉(zhuǎn)錄[2]，該核心序列被激活后可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的細(xì)胞保護(hù)性蛋白，如NADP(H)：醌氧化還原酶1（NQO1）、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）等[3]?；罨腘rf2與ARE 結(jié)合時(shí)，還需與其他bZIP蛋白（如小Maf、JunD、cJun、ATF4等蛋白）形成異二聚體[1]，且需要轉(zhuǎn)錄輔因子參與，特別是CREB-結(jié)合蛋白（CBP）與Nrf2上Neh4和Neh5 2個(gè)轉(zhuǎn)錄激活域相互作用，方能激活下游基因的轉(zhuǎn)錄[2]。Nrf2的N末端富含谷氨酸和天冬氨酸。

1.1.2 Keap1 Keap1即Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1，也被稱作INrf2，對(duì)Nrf2起著重要的負(fù)調(diào)節(jié)作用。在生理狀態(tài)下，Nrf2的N末端上Neh2結(jié)構(gòu)與Keap1的C末端上Kelch重復(fù)區(qū)域結(jié)合，鉚合在肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架上。Keap1的 N末 端 是 BTB（broad complex，tram-track，bric-a-brac）結(jié)構(gòu)，與其他BTB家族蛋白相似，是Cullin依賴性E3泛素連接酶的作用底物，可致使Nrf2泛素化并最終被Cullin依賴性E3泛素連接酶降解，所以BTB域是Cul3/Rbx1誘導(dǎo)Nrf2降解時(shí)的中間接合物[4]。分子遺傳學(xué)證據(jù)顯示，位于Nrf2上Neh2域的7個(gè)賴氨酸殘基中的一個(gè)是Nrf2被Keap1泛素化的靶標(biāo)。在化學(xué)/氧化應(yīng)激條件下，細(xì)胞中Nrf2可逃離Keap1的抑制，通過Nrf2上Neh1域的一個(gè)核轉(zhuǎn)位信號(hào)而在細(xì)胞核中蓄積，并激活A(yù)RE調(diào)節(jié)的靶基因。Keap1的C末端是DGR（double glycine repeat）結(jié)構(gòu)，為肌動(dòng)蛋白結(jié)合區(qū)，對(duì)鉚定Nrf2起重要作用[5]。

1.1.3 Nrf2與Keap1的相互作用 Keap1在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中以同源二聚體形式存在，并以這種形式與一個(gè)單分子Nrf2結(jié)合。對(duì)于Nrf2與Keap1的結(jié)合，近來(lái)的研究提出了一個(gè)“鉸鏈與門閂（hinge and latch）”的相互作用理論。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2上Neh2域中存在2個(gè)不同的Keap1結(jié)合位點(diǎn)，即保守的29DLG31和79ETGE83基序，其可與Keap1上DGR域中一個(gè)獨(dú)立重疊的部位緊密結(jié)合，從而保證泛素的有效轉(zhuǎn)移和Nrf2被蛋白酶體降解；在正常情況下，Keap1與高親和力的ETGE基序結(jié)合后，可使Nrf2相對(duì)自由地移動(dòng)，類似于“鉸鏈”，而同時(shí)與低親和力的DLG域結(jié)合后，嚴(yán)格限制了Nrf2使其靶賴氨酸處于與泛素結(jié)合的最佳位置，類似于“門閂”；而在化學(xué)/氧化應(yīng)激條件下，由于Keap1失去與DLG的“門閂”式結(jié)合，導(dǎo)致Nrf2泛素化受阻，且同時(shí)因Nrf2上靶賴氨酸的位置出現(xiàn)偏差，Nrf2不再能被蛋白酶體降解，但可能由于ETGE的“鉸鏈”式連接仍存在，致使Keap1與Nrf2的結(jié)合處于飽和狀態(tài)，任何新合成的Nrf2得以在細(xì)胞核蓄積，并激活細(xì)胞保護(hù)性基因，從而對(duì)細(xì)胞應(yīng)激起解毒作用[6]。

1.2 Nrf2激活的觸發(fā)因素

1.2.1 Keap1上的氨基酸殘基 大量研究數(shù)據(jù)表明，Keap1上某些確定的半胱氨酸殘基可能是誘導(dǎo)Nrf2和細(xì)胞保護(hù)性酶等親電子化合物的靶標(biāo)。靶標(biāo)定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)顯示，Keap1上Cys-151、-273和-288對(duì)Keap1功能發(fā)揮起至關(guān)重要的作用，這些半胱氨酸殘基也可能就是Nrf2等親電子誘導(dǎo)劑的靶標(biāo)，其中，Cys-151位于Keap1的BTB域，在化學(xué)/氧化應(yīng)激條件下，可使Nrf2的抑制和泛素化減少，是誘導(dǎo)Nrf2從Keap1中釋放的關(guān)鍵靶位，而Cys-273和-288處于Keap1上半胱氨酸豐富的插入?yún)^(qū)（IVR），在生理?xiàng)l件下其抑制Keap1活性的作用十分必要，在Keap1上Cys-273和-288發(fā)生突變的細(xì)胞中，Nrf2活化分子的反應(yīng)性降低或消除[7]。此外，新近的研究發(fā)現(xiàn)，Keap1上還有其他靶位的作用也可將Nrf2從抑制中解除而激活。例如，Keap1對(duì)Nrf2的抑制作用還依賴于其是否能形成二聚體，Keap1上104位保守的絲氨酸殘基（Ser-104）在二聚化過程中起重要作用，其突變將導(dǎo)致Keap1二聚體的解離和Nrf2的釋放；而Keap1上141位酪氨酸（Tyr-141）的磷酸化和脫磷酸化也能調(diào)節(jié)Keap1的穩(wěn)定性和降解，Tyr-141的磷酸化是Keap1維持穩(wěn)定所必需的，Tyr-141的脫磷酸化則會(huì)導(dǎo)致Nrf2的釋放[2]。

1.2.2 Nrf2的磷酸化 半胱氨酸殘基的存在是Nrf2活化分子的一個(gè)共同特征，而磷酸化信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活也可能刺激Nrf2依賴性細(xì)胞防御，如可促進(jìn)蛋白高度磷酸化的蛋白磷酸酶抑制劑岡田酸在HepG2細(xì)胞中能刺激Nrf2的核蓄積和ARE受體轉(zhuǎn)基因的激活[8]。許多研究顯示，作為對(duì)Nrf2功能的一個(gè)調(diào)節(jié)性影響，磷酸化過程可通過藥理上抑制特異性蛋白激酶而起作用，這將減弱Nrf2被已知的活性分子的誘導(dǎo)；抑制一條蛋白激酶通路確實(shí)對(duì)多種細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過程有顯著影響，并可能影響Nrf2信號(hào)傳導(dǎo)通路的完整性[9]。而另有研究顯示，蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase, ERK）、PKR樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase , PERK）、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）等的磷酸化作用會(huì)促進(jìn)Nrf2和Keap1的解離[10]。目前，研究得比較透徹的是，PKC致使Nrf2上Neh2域的Ser-40磷酸化，能導(dǎo)致Nrf2與Keap1的解離；Nrf2的翻譯后修飾也會(huì)誘導(dǎo)激活A(yù)RE[11]。但最近有實(shí)驗(yàn)研究表明，酪氨酸激酶Fyn致使Nrf2上Tyr-568磷酸化后，可使Nrf2從核中移出[12]。因此，Nrf2的磷酸化過程可能是其激活和失活的一個(gè)重要信號(hào)傳導(dǎo)事件，可分別促進(jìn)Nrf2的核蓄積和從細(xì)胞核中移出[3]。

1.3 Nrf2失活的機(jī)制

最新的研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2活化進(jìn)入細(xì)胞核后，可由一個(gè)涉及多功能絲氨酸/蘇氨酸激酶GSK-3β的延遲機(jī)制來(lái)調(diào)控Nrf2誘導(dǎo)的基因表達(dá)，GSK-3β能使Fyn上未知的蘇氨酸殘基磷酸化，導(dǎo)致Fyn的核易位，促使Fyn將Nrf2上Tyr-568磷酸化，并使Nrf2從核中移出[7]。此外，Bach1(BTB and CNC homology 1，basic leucine zipper transcription factor 1)是一種轉(zhuǎn)錄阻抑蛋白，在無(wú)細(xì)胞應(yīng)激時(shí)，可與小Maf蛋白形成異二聚體而結(jié)合在ARE上，抑制基因表達(dá)，但當(dāng)細(xì)胞應(yīng)激時(shí)，則成為與Nrf2競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合ARE的核蛋白，抑制Nrf2下游基因[13]?？梢?，F(xiàn)yn 和Bach1信號(hào)通路對(duì)Nrf2的負(fù)性調(diào)節(jié)，可在氧化應(yīng)激條件下抑制Nrf2誘導(dǎo)的下游基因表達(dá)。還有實(shí)驗(yàn)研究顯示，前列腺素-α介導(dǎo)了Keap1/Cul3-Rbx1復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核，且在細(xì)胞核中，Nrf2替換前列腺素-α而與該復(fù)合物結(jié)合，導(dǎo)致Nrf2的泛素化和降解，這可能是細(xì)胞在氧化應(yīng)激條件下調(diào)節(jié)Nrf2核內(nèi)水平以及快速停止Nrf2下游基因表達(dá)的方式[14]。而且，Nrf2信號(hào)傳導(dǎo)通路也存在著一種自動(dòng)調(diào)控機(jī)制，這種開/關(guān)機(jī)制能保護(hù)細(xì)胞免受自由基及射線的損傷，預(yù)防細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞存活率[15]。

1.4 相關(guān)基因的多態(tài)性

最近，有實(shí)驗(yàn)在多種族人群肝組織中的Nrf2基因啟動(dòng)子區(qū)域鑒別出一些單核苷酸多態(tài)性（SNP），而對(duì)這些SNP進(jìn)行功能分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，具有其中一種SNP的肝組織在體外暴露于氧化應(yīng)激時(shí)，這種SNP可使Nrf2與ARE啟動(dòng)子的結(jié)合減弱。重要的是，有這種SNP的個(gè)人相較于有正常Nrf2序列的個(gè)人，更容易在大面積外傷時(shí)發(fā)展成急性肺損傷，顯示出Nrf2的異?；钚詫?duì)人類急性疾病發(fā)展的作用[16]。還有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在一些受Nrf2調(diào)節(jié)的細(xì)胞保護(hù)性基因啟動(dòng)子區(qū)域的ARE上也存在SNP。提示，Nrf2信號(hào)通路相關(guān)基因的多態(tài)性可能逆轉(zhuǎn)人類某些疾病的進(jìn)程[17]。

2 Nrf2信號(hào)通路在肝組織中的作用

2.1 對(duì)肝代謝酶表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

肝代謝酶對(duì)進(jìn)入體內(nèi)的食物、藥物或環(huán)境污染物等外源性化合物的排出和解毒至關(guān)重要，機(jī)體對(duì)外源性化合物毒性的易感性依賴于相關(guān)代謝酶的活性。肝代謝酶的解毒過程理論上包括3個(gè)連續(xù)代謝反應(yīng)，即1相、2相和3相代謝。在1相代謝中，外源性化合物被CYP450系統(tǒng)代謝而增加或暴露功能基團(tuán)，其產(chǎn)物時(shí)常具有高活性，易與細(xì)胞蛋白或DNA結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞毒性和致癌性；由于1相代謝產(chǎn)物具有親電子性，使其易于誘導(dǎo)2相代謝系統(tǒng)酶，其中包括NQO1、GST、尿苷二磷酸葡萄糖苷酸轉(zhuǎn)移酶（UDP-glucuronosyltransferase,UGT）、硫酸基轉(zhuǎn)移酶（sulfotransferase, SULT）等，這些酶能催化有活性的1相代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)楦哂H水性和穩(wěn)定性的產(chǎn)物；在3相代謝中，外源性化合物的代謝產(chǎn)物可被包括多藥耐藥蛋白（multidrug resistanceassociated protein, Mrp）的細(xì)胞膜外排泵排出?？梢姡?相和3相代謝反應(yīng)能通過轉(zhuǎn)化和排出功能，在保護(hù)器官組織免受外源性化合物損傷中發(fā)揮重要作用。Nrf2則可通過ARE序列協(xié)同調(diào)節(jié)一系列2相代謝酶基因的表達(dá)和3相代謝酶中一種載體的表達(dá)[8]。

1相和2相代謝酶是由共同的啟動(dòng)子元件調(diào)控。由轉(zhuǎn)錄因子芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor, AhR)激活的異源性物質(zhì)反應(yīng)元件（xenobiotic responsive element, XRE）主要調(diào)節(jié)1相代謝酶表達(dá)。Nrf2與小Maf蛋白家族形成二聚體結(jié)合到2相代謝酶基因5'上游的ARE元件啟動(dòng)子區(qū)域，促使2相代謝酶基因的轉(zhuǎn)錄、活化。AhR與Nrf2是2個(gè)重要但又相互區(qū)別的代謝酶調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，二者不僅在調(diào)節(jié)代謝酶基因表達(dá)上相互協(xié)同，而且在調(diào)節(jié)水平上相互作用。有研究發(fā)現(xiàn)AhR可直接激活Nrf2誘導(dǎo)代謝酶基因轉(zhuǎn)錄，提示Nrf2/ARE可能位于AhR/XRE下游的一個(gè)調(diào)節(jié)性靶序列。另有研究提出，其他可能的相互作用還有：1）由CYP1A1誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧簇 ( reactive oxygen species,ROS)/親電子化合物可非直接激活Nrf2；2）由于XRE和ARE對(duì)NQO1基因的調(diào)節(jié)區(qū)域相似，所以AhR/XRE和Nrf2/ARE可直接相互作用。AhR對(duì)Nrf2的直接作用表明，二者在對(duì)1、2相代謝酶的調(diào)節(jié)水平上形成了一個(gè)完整的體系，有利于對(duì)外源性化合物和致癌物的解毒[18]。

2.2 對(duì)藥物性肝損傷的保護(hù)作用

某些藥物在肝細(xì)胞內(nèi)經(jīng)CYP450代謝而產(chǎn)生的親電子物、自由基、氧基等可與肝細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)共價(jià)結(jié)合，引起膜系統(tǒng)脂質(zhì)過氧化，破壞膜完整性和膜Ca2+-ATP酶系，擾亂細(xì)胞內(nèi)外Ca2+穩(wěn)態(tài)，影響線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等重要細(xì)胞器的功能，并最終導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷甚至死亡。對(duì)乙酰氨基酚(APAP)介導(dǎo)的肝損害是評(píng)估藥物性肝損害的經(jīng)典模型，可導(dǎo)致活性親電子體的增加、還原型谷胱甘肽（GSH）的排空以及氧化應(yīng)激。在正常情況下，治療劑量的APAP在體內(nèi)大多可與葡萄糖醛酸和硫酸結(jié)合而解毒，少部分則在CYP1A2、2E1和3A4的作用下，轉(zhuǎn)化為反應(yīng)性代謝產(chǎn)物N-乙酰-對(duì)苯醌亞胺(N–acetyl-p-benzoquinonimine, NAPQI)， 其 與 GSH 結(jié)合形成硫醇尿酸和半胱氨酸衍生物而解毒。但過量服用的APAP可耗竭肝細(xì)胞內(nèi)的GSH，致使NAPQI與細(xì)胞內(nèi)大分子結(jié)合，誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，生成大量ROS，造成過氧化損傷，而線粒體中 ROS的增多，可導(dǎo)致進(jìn)一步的脂質(zhì)氧化，生成更多的脂質(zhì)過氧化物，且可誘導(dǎo)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)產(chǎn)生，TNF-α不僅會(huì)損傷線粒體呼吸鏈功能，影響呼吸鏈上電子傳遞，還會(huì)使線粒體的滲透性轉(zhuǎn)換孔道開放，耗竭線粒體中細(xì)胞色素C，繼而觸發(fā)肝細(xì)胞凋亡、壞死[19]。

Nrf2對(duì)藥物介導(dǎo)的肝損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制被推測(cè)可能是，誘導(dǎo)UGT1A6表達(dá)增加，導(dǎo)致葡萄糖苷酸化增加和APAP的排泄增加；激活Nrf2依賴性適應(yīng)性反應(yīng)。APAP在非毒性劑量下可激活Nrf2，使其核易位，Nrf2在協(xié)調(diào)適應(yīng)性反應(yīng)中的作用導(dǎo)致APAP毒性的減弱，這種適應(yīng)性反應(yīng)導(dǎo)致GSH從頭合成增多以及APAP活性代謝產(chǎn)物與GSH結(jié)合并排出的增多。在一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究中，將大鼠肝細(xì)胞中Keap1基因敲除，觀察Nrf2的持續(xù)活化如何影響大鼠的解毒系統(tǒng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Keap1(-/-)模型大鼠肝細(xì)胞核中Nrf2蓄積增多，肝組織中典型的Nrf2依賴性基因表達(dá)水平升高，該模型大鼠比對(duì)照組正常大鼠能更加耐受毒性劑量APAP所引起的肝毒性[13]。而Nrf2（-/-）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)則發(fā)現(xiàn)，此模型動(dòng)物對(duì)APAP和其他化學(xué)物質(zhì)引起的急性毒性非常敏感，表現(xiàn)為血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）升高和肝小葉壞死，并導(dǎo)致存活率降低[20]。

需要注意的是，有些實(shí)驗(yàn)中，Keap1(-/-)模型鼠在斷奶前即死亡，解剖發(fā)現(xiàn)是由于食道和賁門竇的過度角化損傷而引起上消化道阻塞所致；且在Keap1(-/-)模型鼠肝細(xì)胞中，一些Nrf2/ARE依賴性基因，如血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)、谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基 (glutamate-cysterine ligase catalytic subunit，GCLC)、過氧化物酶-1(peroxiredoxin-1，Prdx-1)等的基因表達(dá)水平并未見提高，提示體內(nèi)ARE依賴性基因的調(diào)控機(jī)制具有多樣性。HO-1基因的調(diào)控可能涉及抑制蛋白Bach1和Nrf2競(jìng)爭(zhēng)與ARE相互作用，Prdx-1基因則可能會(huì)因細(xì)胞譜系的不同而在肝細(xì)胞中呈現(xiàn)不同的表達(dá)水平，而GCLC基因可能需要Nrf2修飾和（或）誘導(dǎo)的輔激活因子來(lái)激活[8]。

2.3 對(duì)癌變的作用

致癌過程是環(huán)境和遺傳因素相互作用而引起多基因突變及其他生物大分子改變積累的結(jié)果，是涉及癌變啟動(dòng)、促進(jìn)和進(jìn)展等多階段的復(fù)雜過程?；瘜W(xué)致癌物在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化依靠肝臟的1相和2相代謝酶來(lái)完成，其經(jīng)1相代謝酶催化后形成具親電子活性的致癌物，并與DNA及蛋白質(zhì)結(jié)合形成加合物，引起癌基因和抑癌基因的改變；而其經(jīng)2相代謝酶的解毒作用則可阻斷或逆轉(zhuǎn)癌癥發(fā)生[21]。2相代謝酶的誘導(dǎo)不僅不會(huì)增加反而能降低致癌風(fēng)險(xiǎn)，因此誘導(dǎo)2相酶的化學(xué)物質(zhì)被認(rèn)為對(duì)癌變具有化學(xué)預(yù)防能力。Nrf2是調(diào)節(jié)2相代謝酶表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子，通過與靶基因的ARE元件結(jié)合，調(diào)節(jié)多種解毒酶的表達(dá)，并可上調(diào)細(xì)胞保護(hù)性酶，如GST和NQO1。先前的研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2的激動(dòng)劑CDDO-Im可預(yù)防黃曲霉素介導(dǎo)的肝細(xì)胞癌前病變，而抑制Nrf2向細(xì)胞核易位，則會(huì)加重氧化應(yīng)激，引發(fā)非諾貝特介導(dǎo)的肝癌病變[22]。已有研究表明，吃十字花科蔬菜可降低癌癥發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)[23]，而萊菔硫烷是花莖甘藍(lán)和其他十字花科蔬菜中高濃度存在的葡萄糖異硫氰酸鹽經(jīng)芥子酶催化代謝所形成的一種異硫氰酸鹽復(fù)合物，可強(qiáng)效誘導(dǎo)Nrf2調(diào)節(jié)的細(xì)胞保護(hù)性適應(yīng)性反應(yīng)，具有化學(xué)防癌活性，但其在臨床上的推廣使用尚需克服水溶性差以及療效的個(gè)體差異等難點(diǎn)[24]。

值得注意的是，目前有大量研究證明，Nrf2對(duì)癌變的發(fā)生可起正反兩方面的作用，即一方面，Nrf2的激活能預(yù)防癌癥，Nrf2激動(dòng)劑如酚類抗氧化劑BHA、1，2-雙硫醇-3-硫酮衍生物奧體普拉（oltipraz）及萊菔硫烷，都能有效激活Nrf2，誘導(dǎo)ARE調(diào)控基因的表達(dá)，從而起到化學(xué)防癌作用；另一方面，長(zhǎng)期處于過高表達(dá)的Nrf2則與惡性癌變相關(guān)聯(lián)，Nrf2的突變可導(dǎo)致其對(duì)Keap1-Cul3E3連接酶的識(shí)別能力降低，細(xì)胞中Nrf2的總表達(dá)量增加，致使其調(diào)控的抗氧化酶、2相解毒酶和藥物外排泵基因的表達(dá)及GSH水平均增加，而GSH和相關(guān)解毒酶參與抗癌藥物及氧化應(yīng)激副產(chǎn)物的解毒作用，所以這些酶系統(tǒng)的正調(diào)節(jié)增強(qiáng)了癌細(xì)胞對(duì)藥物的解毒作用，促進(jìn)了癌變以及癌細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生。因此，在正常細(xì)胞內(nèi)，Nrf2/ARE通路的激活與抑制可被嚴(yán)格調(diào)控，但若該通路失控，將會(huì)引起Nrf2過度激活，其靶基因過量表達(dá)，促進(jìn)癌變的發(fā)生和癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，同時(shí)增強(qiáng)癌細(xì)胞的防御能力[21]。然而，這方面的相關(guān)研究尚很不成熟，而且抑制Nrf2或者激活（增加）Keap1和Bach1的表達(dá)，是否能逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞耐藥性仍不得而知。

2.4 抗炎和抗纖維化作用

許多體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明Nrf2在調(diào)控炎癥中起重要作用，例如，相比于野生型大鼠，Nrf2（-/-）大鼠對(duì)煙草煙霧及彈性酶介導(dǎo)的肺氣腫、變應(yīng)原導(dǎo)致的氣道炎癥、角叉菜聚糖引起的胸膜炎和硫酸葡聚糖鈉所致大腸炎都更加敏感。在急性炎癥動(dòng)物模型中，呈現(xiàn)Nrf2依賴性的抗氧化酶表達(dá)的增加和炎癥前細(xì)胞因子的調(diào)控，Nrf2的適應(yīng)性反應(yīng)對(duì)模型動(dòng)物起保護(hù)作用，而炎癥介導(dǎo)的氧化應(yīng)激是活化Nrf2介導(dǎo)細(xì)胞保護(hù)性應(yīng)答的一種刺激。此外，Nrf2信號(hào)傳導(dǎo)通路還可調(diào)控炎癥因子核因子-κB（NF-κB）的活化，經(jīng)脂多糖灌胃的Nrf2（-/-）鼠相較于野生型鼠，其體內(nèi)NF-κB的活性增加[25]。據(jù)估測(cè)，約20%的人類癌癥是由慢性炎癥發(fā)展而來(lái)，而Nrf2可通過上調(diào)抗氧化物酶，減弱細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和氧化損傷，這一適應(yīng)性反應(yīng)在慢性炎癥相關(guān)癌癥中起對(duì)抗性保護(hù)作用[26]。

肝纖維化是肝臟對(duì)各種原因所致肝臟炎癥和損傷后修復(fù)過程的代償反應(yīng)，表現(xiàn)為肝內(nèi)結(jié)締組織增生與沉積，是慢性肝病的重要病理特征，是由肝星狀細(xì)胞（HSC）活化以及細(xì)胞外基質(zhì)（ECM，包括膠原、透明質(zhì)酸、層黏連蛋白、纖維連接蛋白等）合成增多而降解不足所產(chǎn)生，是進(jìn)一步向肝硬化發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。最新的動(dòng)物和臨床研究顯示，在肝纖維化進(jìn)程中，HSC的活化與氧化應(yīng)激相關(guān)，誘導(dǎo)如GCLC和GSTA2類的解毒酶可加速ROS的清除，而Nrf2/ARE對(duì)GCLC、GSTA2和醌氧化還原酶等抗氧化蛋白的表達(dá)至關(guān)重要。有人用內(nèi)源性抗氧化物輔酶Q10(CoQ10)來(lái)治療二甲基亞硝胺（DMN）誘導(dǎo)的鼠肝纖維化，結(jié)果，可能由于CoQ10在醌氧化還原循環(huán)中極少產(chǎn)生ROS，從而提高了Nrf2/ARE的活性，致使肝細(xì)胞中GSTA2、GCLC和醌氧化還原酶的表達(dá)水平均升高[27]。在HSC活化過程中，HSC轉(zhuǎn)化為表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的肌成纖維樣細(xì)胞，而α-SMA是肝纖維化早期的一個(gè)重要檢測(cè)指標(biāo)，也可用于監(jiān)測(cè)治療療效。肝纖維化以肝細(xì)胞損傷為標(biāo)志，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞和血小板的增加及隨后細(xì)胞因子的釋放，包括肝纖維化關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）。TGF-β1可促進(jìn)ECM的沉積，抑制HSC膠原酶的活性，并能通過Smad-3/激活轉(zhuǎn)錄因子（ATF）依賴性抑制Nrf2的活性，下調(diào)GST、GCLC、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化物酶的表達(dá)水平和活性，但Nrf2的活化能否影響TGF-β1的表達(dá)尚不明確。目前，有研究者提出了Nrf2下調(diào)TGF-β1表達(dá)的一種可能機(jī)制：人的TGF-β1啟動(dòng)子區(qū)域在-453bp和-323bp處有2個(gè)轉(zhuǎn)錄激活蛋白-1（AP-1）結(jié)合位點(diǎn)，在靶基因表達(dá)中起重要作用，且TGF-β1基因的激活還需要結(jié)合啟動(dòng)子上轉(zhuǎn)錄因子Zf9和Sp1的結(jié)合區(qū)，而Nrf2或Nrf2依賴性抗氧化蛋白可調(diào)控AP-1 、Zf9或 Sp1活性，從而下調(diào)TGF-β1的表達(dá)[28]。另有研究報(bào)道，Nrf2能調(diào)節(jié)氧化還原敏感性轉(zhuǎn)錄因子家族AP-1和NF-κB的表達(dá)[29]。此外，研究表明許多自然界的抗氧化物如檞皮素、白藜蘆醇等都能抑制HSC活化，它們可能是通過激活Nrf2/ARE有效誘導(dǎo)2相抗氧化物酶而發(fā)揮作用，提示，在肝纖維化進(jìn)程中，Nrf2的激活可能抑制HSC的活化。

2.5 對(duì)非酒精性脂肪肝的保護(hù)作用

非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）是西方發(fā)達(dá)國(guó)家最常見的肝臟疾病，與肥胖癥、2型糖尿病和代謝綜合征中的其他疾病密切相關(guān)。但NAFLD發(fā)病的確切機(jī)制仍不清楚，不過，大量的脂質(zhì)蓄積和脂質(zhì)過氧化誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激被認(rèn)為是引起細(xì)胞毒性和肝病加重的主要原因。

已有研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2-Keap1信號(hào)傳導(dǎo)通路在大鼠脂肪肝模型中具有潛在的保護(hù)作用，其機(jī)制可能是加強(qiáng)抗氧化物和解毒酶基因的表達(dá)，從而防止細(xì)胞脂質(zhì)過氧化，同時(shí)減少脂肪酸從脂肪組織中釋放和肝對(duì)脂肪酸的攝??；而給予Nrf2（-/-）大鼠以含酒精或高脂飲食，可導(dǎo)致其出現(xiàn)比相同飲食的野生型大鼠更為嚴(yán)重的肝損傷[30]。

在一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，分別給予Nrf2（-/-）、野生型和Keap1(-/-)小鼠以蛋氨酸和膽堿缺乏（methionineand choline- deficient, MCD）飲食或正常飲食作對(duì)照，持續(xù)5 d，其中MCD飲食可通過增加小鼠肝細(xì)胞對(duì)脂肪酸的攝取和降低極低密度脂蛋白中三酰甘油酯的分泌而促進(jìn)肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予MCD飲食的Nrf2（-/-）小鼠血清膽紅素、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平均高于相同飲食的野生型和Keap1(-/-)小鼠，表明Nrf2的缺乏致使小鼠對(duì)MCD飲食誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂肪變性和肝損傷的易感性增強(qiáng)；Nrf2（-/-）小鼠肝臟中GSH含量最低并表現(xiàn)出更多的脂質(zhì)過氧化，而在野生型小鼠肝臟中Nrf2靶基因NQO1和GSTα 1/2被誘導(dǎo)激活，且在Keap1(-/-)小鼠中更明顯[31]。

Nrf2保護(hù)肝細(xì)胞免受脂質(zhì)過氧化損傷的機(jī)制可能是作用于肝內(nèi)Fas、Fgf21和CD36的基因。Fas是脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，F(xiàn)gf21是肝臟分泌的一種促進(jìn)白色脂肪組織脂解的激素，而CD36是一種脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)體，可使攝取的長(zhǎng)鏈脂肪酸易于進(jìn)入肝臟。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，野生型鼠經(jīng)MCD飲食3周后，肝臟中Fas含量減少，這被認(rèn)為是抵抗肝細(xì)胞脂肪變性的保護(hù)性應(yīng)答；且該類鼠肝臟中Fgf21和CD36的mRNA水平低于相同飲食的Nrf2（-/-）鼠，但高于相同飲食的Keap1(-/-)鼠。此外，該研究還表明，Nrf2可能通過對(duì)肝內(nèi)Fas、Fgf21和CD36的基因的作用來(lái)影響全身的能量分布[32]。

3 Nrf2的誘導(dǎo)劑和抑制劑

人們已將Nrf2誘導(dǎo)劑應(yīng)用于各種體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，發(fā)現(xiàn)單功能誘導(dǎo)劑可有效對(duì)抗肝臟等器官疾病引起的組織損傷，并驗(yàn)證了其功效在很大程度上依賴于對(duì)細(xì)胞中Nrf2/ARE路徑的激活以及隨后對(duì)有抗氧化或解毒功能的2相解毒酶系列基因的誘導(dǎo)作用。

最近的研究表明，Nrf2可被多條信號(hào)通路抑制，如ATF3即為一種Nrf2/ARE的阻遏物，可與Nrf2形成異二聚體，從而減弱CBP與ARE及Nrf2的相互作用，導(dǎo)致Nrf2轉(zhuǎn)錄活性降低；還有，視黃酸可通過其受體（RARα）抑制Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性，因?yàn)镽ARα與Nrf2的相互作用水平提高可減少Nrf2與ARE的結(jié)合，從而降低Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性；抑癌基因p53也能作為阻遏物與ARE結(jié)合而抑制Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性[33]。

4 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，Nrf2信號(hào)通路其實(shí)是一把雙刃劍，即一方面，Nrf2介導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)作用可抵抗急慢性疾病的進(jìn)程；另一方面，Nrf2的持續(xù)激活可能有利于癌細(xì)胞生長(zhǎng)，且可能成為癌細(xì)胞逃避化療藥物攻擊的一個(gè)途徑，給癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性提供了條件[34]。有研究發(fā)現(xiàn)，通過特異的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）來(lái)降低Nrf2的表達(dá)（轉(zhuǎn)錄活性），可逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥，增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性[32]。因此，可設(shè)計(jì)一類以Nrf2負(fù)性調(diào)節(jié)為靶向的新型癌癥防治藥物，而Nrf2信號(hào)通路抑制劑作為抗腫瘤治療增敏劑具有廣闊的臨床開發(fā)與應(yīng)用前景。

未來(lái)對(duì)Nrf2信號(hào)通路的研究應(yīng)著重于進(jìn)一步完善對(duì)Nrf2從Nrf2 /Keap1復(fù)合物中釋放及其靶基因表達(dá)機(jī)制的研究以及Nrf2 /Keap1與細(xì)胞存活和腫瘤耐藥的相關(guān)性及Nrf2信號(hào)通路相關(guān)基因多態(tài)性的研究[24]。

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