Dot-ELISA和RT-PCR檢測(cè)南方水稻黑條矮縮病毒靈敏度的比較

劉珊珊，周 倩，2，高必達(dá)，2，李有志，2，張政斌，郭海明

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2. 植物病蟲害生物學(xué)與防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3. 湖南省植保植檢站，湖南 長(zhǎng)沙 410005）

南方水稻黑條矮縮病毒（Sou thern rice b lackstreaked dwarf virus，SRBSDV）引起的水稻病害由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)周國(guó)輝教授于2001在廣東省首次發(fā)現(xiàn)，2008年被鑒定為斐濟(jì)病毒屬中一暫定新種[1]。該病毒主要通過(guò)白背飛虱傳播，危害水稻，玉米、小麥等禾本科作物和一些田間雜草。最近幾年由SRBSDV引起的水稻矮縮病在我國(guó)南方和越南發(fā)生嚴(yán)重。2009年湖南、江西等九省受害面積達(dá)到數(shù)千公頃，2010年，發(fā)病范圍擴(kuò)大至西南及長(zhǎng)江中下游部分單季稻區(qū)，江淮局部地區(qū)也檢測(cè)到感病植株，且感病程度逐年加重，由零星田塊分布轉(zhuǎn)為連片分布，個(gè)別田塊甚至絕收[2]。2011、2012年全國(guó)南方黑條矮縮病發(fā)生程度比前幾年低，但發(fā)生地區(qū)更集中[3]。南方水稻黑條矮縮病一旦發(fā)生，目前沒(méi)有有效的治療藥劑，因此病害的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)對(duì)病害防治至關(guān)重要。檢測(cè)白背飛虱、田間雜草和水稻植株的帶毒率是病害預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)的基礎(chǔ)。

目前檢測(cè)病毒常用的方法大致分為分子檢測(cè)技術(shù)和血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)兩類。分子檢測(cè)技術(shù)是一種基于核酸水平的檢測(cè)，具有準(zhǔn)確高效、靈敏快速的特點(diǎn)，但操作比較復(fù)雜，成本高。血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)是以抗原抗體特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)，具有快速靈敏經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，并且操作簡(jiǎn)單，但如果抗體非特異性結(jié)合容易造成假陽(yáng)性[4-7]。為了尋找一種適合SRBSDV大量樣本檢測(cè)的方法，比較了RT-PCR和Dot-ELISA兩種檢測(cè)方法的靈敏度，以期為基層植保人員檢測(cè)SRBSDV提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料 2012年湖南省郴州北湖區(qū)經(jīng)檢測(cè)感染SRBSDV的水稻植株。

1.1.2 介體材料 室內(nèi)人工飼毒的白背飛虱群體，經(jīng)過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)獲得帶毒蟲汁液及RNA。

1.1.3 試 劑 南方水稻黑條矮縮病毒（SRBSDV）Dot-ELISA試劑盒（農(nóng)業(yè)部農(nóng)技技推廣中心），Trizol（TaKaRa），5×first stand buffer ，M-M LV反轉(zhuǎn)錄酶（均購(gòu)自Invitrogen），Taq DNA聚合酶，dNTP，10×PCRbu ffer，DNase/RNase-Free去離子水（天根生化科技有限公司），GoldenVieⅡ（Solarbio）隨機(jī)引物（上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司），Trans2K DNA Marker，Trans2K Plus II DNA Marker（北京全式金生物技術(shù)有限公司），特異性引物：S10F為5'-TTAAGTTTATTCGCAACTTCGAAG-3'，S10R為5'-GTGATTTGTCAGCATCTAAAGCG-3'[8]。

1.2 方 法

1.2.1 樣品處理 植物材料：取1 g患病水稻莖稈于液氮中反復(fù)研磨至粉末狀，部分粉末轉(zhuǎn)移至2支離心管，分別稱重，再進(jìn)行RT-PCR和Dot-ELISA檢測(cè)。

介體材料：取單頭白背飛虱于離心管中，加20 μL的PBS研磨， 5 000 g離心3 m in后，分別取10 μL研磨液于新離心管，分別進(jìn)行RT-PCR和dot-ELISA檢測(cè)。

1.2.2 RT-PCR檢測(cè) （1）總RNA提取。向上述樣品處理物中加入1 m L Trizol，渦旋器上振蕩混勻。然后加入500 μL的氯仿/異戊醇（24∶1），混勻，冰浴靜置10 m in。4℃ 12 000 g 離心15 m in，取上層水相，轉(zhuǎn)移至另一新離心管。加入等體積異丙醇，混勻， 冰浴放置30 m in，4℃ 12 000 g 離心10 m in，棄上清，加入1 m L 70%乙醇，懸浮沉淀，4℃ 7 500 g 離心5 m in，盡量棄上清。加入1 m L無(wú)水乙醇，懸浮沉淀，4℃ 7 500 g 離心5 m in，盡量棄上清。室溫或真空干燥1 m in，加入30 μL DNase/RNase-Free去離子水，－20℃保存?zhèn)溆茫ò妆筹w虱研磨液加200 μL Trizol和100 μL的氯仿/異戊醇抽提，其余步驟相同，沉淀最后溶于10 μL DNase/RNase-Free去離子水）。

（2）植物材料RNA稀釋。取1 μL總RNA用DNase/RNase-Free去離子水進(jìn)行5倍、10倍、20倍、100倍、1 000倍、5 000倍稀釋。

（3）白背飛虱RNA稀釋。取1 μL總RNA用DNase/RNase-Free去離子水進(jìn)行5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、500倍、1 000倍、5 000倍稀釋。

（4）反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)總體積20 μL，分別加入DNase/RNase-Free去離子水9 μL，隨機(jī)引物1 μL，上述經(jīng)稀釋的RNA樣品3 μL，65℃水浴5 m in，立即冰上孵育5 m in， 繼續(xù)加入5×first stand buffer 4 μL， dNTP（10 mmol/L）2 μL，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（200 U/μL）1 μL，在42℃水浴1 h，得到cDNA。

（5）PCR擴(kuò)增：反應(yīng)總體積25 μL，DNase/RNase-Free去離子水17.5 μL，10×PCR buffer 2 μL，dNTP（10 mmol/L） 0.5 μL，S10F（10 μ mol/L） 1 μL ， S10R（10 μ m ol/L） 1 μL，TaqDNA聚合酶（2.0 U）0.5 μL，cDNA 2 μL。擴(kuò)增程序?yàn)槭紫?5℃預(yù)變性5 m in，然后95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃ 延伸45 s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 m in。反應(yīng)結(jié)束后，取8 μL反應(yīng)產(chǎn)物，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，Golden View Ⅱ染色，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察照相。

1.2.3 Dot-ELISA檢測(cè) （1）樣品的制備與稀釋。取上述植物材料樣品處理物，加入5.2 m L的PBS（PBS按試劑盒說(shuō)明書 樣品∶PBS = 1 g∶20 m L 加入），裝入離心管，5 000 g， 離心3 m in。取上清液做為原液，用PBS進(jìn)行5×、10×、20×、100×、1 000×、5 000×稀釋；取白背飛虱樣品處理物用PBS進(jìn)行5×、10×、20×、50×、100×、500×、1 000×、5 000×稀釋。

（2）點(diǎn)樣。用鑷子取一張NC膜放置干凈的培養(yǎng)皿內(nèi)，分別取2 μL原液及稀釋后的液體輕點(diǎn)到NC膜上，每個(gè)樣品更換槍頭。

（3）干燥。樣品點(diǎn)膜完成后在室溫下干燥10～20 m in。

（4）封閉。先往干凈的空培養(yǎng)皿中加入1 g脫脂奶粉，然后加入2 m L 10×濃縮封閉液和18 m L去離子水，用槍頭抽吸混勻，再把NC膜放入稀釋好的封閉液中，搖床上室溫封閉30 m in。

（5）一抗孵育。依次往干凈的空培養(yǎng)皿中加入1 g脫脂奶粉，2 m L 10×濃縮抗體稀釋液和18 m L去離子水，槍頭抽吸混勻后加入10 μL SRBSDV單克隆抗體，再晃動(dòng)混勻，放入NC膜，搖床上室溫孵育30～60 m in。

（6）洗滌。用去離子水將20×濃縮洗滌液稀釋成1×洗滌液（即1 m L20×濃縮洗滌液+19 m L去離子水），取20～30 m L洗滌液至空培養(yǎng)皿中，放入NC膜，輕輕晃動(dòng)洗滌，每次3 m in，共4次。

（7）二抗孵育。依次往干凈的空培養(yǎng)皿中加入1 g脫脂奶粉，2 m L 10×濃縮抗體稀釋液和18 m L去離子水，槍頭抽吸混勻，然后加入3 μL AP標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗（白背飛虱樣品處理物加入10 μL HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗），再晃動(dòng)混勻，放入NC膜，搖床上室溫孵育30~60 m in。

（8）洗滌。取20~30 m L洗滌液至空培養(yǎng)皿中，放入NC膜，輕輕晃動(dòng)洗滌，每次3 m in，共5次；

（9）顯色底物液配制。在一個(gè)干凈的培養(yǎng)皿中依次加入10 m L底物緩沖液，66 μL NBT和33 μL BCIP，晃動(dòng)混勻。

（10）顯色及終止。將洗好的NC膜用濾紙吸干后放入上述顯色底物液中避光顯色，待陽(yáng)性對(duì)照顯色明顯，而陰性對(duì)照沒(méi)有任何顯色時(shí)終止反應(yīng)，即在自來(lái)水中漂洗一下，洗去底物，肉眼觀察結(jié)果，并記錄（白背飛虱樣品處理物加入2 m L TMB顯色液直接顯色）。

2 結(jié)果與分析

2.1 帶毒水稻的檢測(cè)

RT-PCR檢測(cè)方法最終可以檢測(cè)到RNA的最大稀釋倍數(shù)為原液的1 000×（結(jié)果見(jiàn)圖1）。稱取的植物材料樣品處理物0.261 g，提取的總RNA，溶于DNase/RNase-Free去離子水，取1/10 的RNA做20 μL反應(yīng)體系的RTPCR，再?gòu)闹腥?/10的RT產(chǎn)物做25 μL反應(yīng)體系為的PCR，最后取8/25的反應(yīng)液跑膠。檢測(cè)到稀釋1 000×的RNA，通過(guò)計(jì)算得出能被檢測(cè)的最小感病組織重量為0.83 μg。

Dot-ELISA檢測(cè)方法最終可以檢測(cè)到的最大稀釋倍數(shù)為原液的20×（結(jié)果見(jiàn)圖2）。稱取的植物材料樣品為0.265 g，按試劑盒要求加入5.3 m L PBS，經(jīng)梯度稀釋，分別取2 μL 點(diǎn)樣在NC膜上，經(jīng)計(jì)算得出原液樣品組織重量為100 μg。最終能被檢測(cè)的最小感病組織重量為5.0 μg。

圖1 RT-PCR技術(shù)檢測(cè)帶毒水稻Fig.1 Detection of diseased rice plants by RT-PCR

圖2 Do t-ELISA技術(shù)檢測(cè)帶毒水稻Fig.2 Detection of diseased rice p lants by Dot-ELISA

2.2 帶毒白背飛虱的檢測(cè)

取單頭白背飛虱于離心管中，加20 μL的PBS研磨，5 000 g 離心3 m in后，分別取10 μL研磨液于新離心管，進(jìn)行RT-PCR和Dot-ELISA檢測(cè)。采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)方法最終可以檢測(cè)到的最大稀釋倍數(shù)為原液的100倍（結(jié)果見(jiàn)圖3），Dot-ELISA檢測(cè)方法結(jié)果能檢測(cè)到原液（結(jié)果見(jiàn)圖4）。

3 討 論

分別用RT-PCR和Dot-ELISA檢測(cè)感病水稻和帶毒飛虱并比較了兩種檢測(cè)方法的靈敏度，兩種方法所檢測(cè)材料來(lái)自同一株水稻和同一頭白背飛虱，結(jié)果具有可比性。試驗(yàn)結(jié)果表明，RT-PCR檢測(cè)技術(shù)比Dot-ELISA檢測(cè)技術(shù)更靈敏。Dot-ELISA技術(shù)檢測(cè)結(jié)果容易受到溫度、顯色時(shí)間長(zhǎng)短的影響，樣品內(nèi)的一些成分，如蛋白質(zhì)、內(nèi)源性酶、葉綠素等也會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果，導(dǎo)致其靈敏性比RT-PCR技術(shù)低[9-11]。然而，Dot-ELISA檢測(cè)技術(shù)在檢測(cè)樣品原液時(shí)，其檢測(cè)結(jié)果和RT-PCR檢測(cè)技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果具有一致性，由于其操作較RT-PCR技術(shù)簡(jiǎn)

圖3 RT-PCR技術(shù)檢測(cè)帶毒白背飛虱Fig.3 Detection of diseased white-backed planthopper by RT-PCR

圖4 Do t-ELISA技術(shù)檢測(cè)白背飛虱Fig.4 Detection of diseased white-backed p lanthopper by Dot-ELISA

單，適用于大規(guī)模樣品的檢測(cè)。在做南方水稻黑條矮縮病的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)時(shí)往往需要大量檢測(cè)白背飛虱帶毒率，判斷病害發(fā)展情況，Dot-ELISA技術(shù)可以通過(guò)擴(kuò)大NC膜的面積來(lái)增大檢測(cè)樣品的數(shù)目，更簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、快速。對(duì)于水稻植株的檢測(cè)，由于SRBSDV與RBSDV的CP蛋白的氨基酸序列同源性很高，Dot-ELISA技術(shù)在檢測(cè)感病水稻時(shí)無(wú)法區(qū)別南方水稻黑條矮縮病和水稻黑條矮縮病[12]，而RT-PCR技術(shù)基于高度特異性的引物可以區(qū)別二者[13]。因此，建議在檢測(cè)感病植株時(shí)采用RT-PCR檢測(cè)技術(shù)，檢測(cè)白背飛虱則選擇Dot-ELISA技術(shù)。

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