發(fā)酵酸菜中鼠李糖乳桿菌的分離及其生物活性

周鮮嬌，饒穎竹，*，黃婷娟，陳 蓉

（1.嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東湛江 524048；2.嶺南師范學(xué)院應(yīng)用生物技術(shù)研究所，廣東湛江 524048）

發(fā)酵酸菜中鼠李糖乳桿菌的分離及其生物活性

周鮮嬌1，2，饒穎竹1，2，*，黃婷娟1，陳 蓉1，2

（1.嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東湛江 524048；2.嶺南師范學(xué)院應(yīng)用生物技術(shù)研究所，廣東湛江 524048）

從自然發(fā)酵酸菜中分離出20株菌，經(jīng)革蘭氏染色后得到12株革蘭氏陽性菌，對這12株菌進行形態(tài)學(xué)特征的觀察、室溫下產(chǎn)酸速率的測定以及乳酸定性后篩選出7株高產(chǎn)乳酸的乳桿菌，運用經(jīng)典分類法對這7株高產(chǎn)乳酸菌株進行生理生化實驗鑒定，初步鑒定該7株菌均為鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）。通過牛津杯法研究該7菌株抑菌效果；通過對羥自由基、DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除效果來檢測該7株菌的抗氧化性。結(jié)果表明，除了LR6菌發(fā)酵液對枯草桿菌無抑菌效果外，該7株菌對大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，蘇云菌桿菌均有抑菌作用，其他6株菌對枯草桿菌也有明顯的抑菌效果；在抗氧化性方面，該7株菌的發(fā)酵液對羥自由基、DPPH自由基和超氧陰離子自由基具有明顯清除作用，抗氧化效果顯著。

酸菜，乳酸菌，抑菌，氧化性

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一類能利用可發(fā)酵糖產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌統(tǒng)稱[1]，乳酸可分為L-乳酸、D-乳酸和DL-乳酸，而人體內(nèi)只有L-乳酸脫氫酶，因此只能利用L-乳酸，WTO規(guī)定3月以下的嬰兒食品中不能含有D型和DL型乳酸，而且成人每日攝入D型乳酸量不超過100mg/kg[2]。而鼠李糖乳桿菌LGG發(fā)酵過程中只產(chǎn)生L-乳酸，不會產(chǎn)生其他酸類[3]，因此鼠李糖乳桿菌應(yīng)用到食品中發(fā)酵具有非常重要的安全意義。鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）最初是在20世紀(jì)80年代，由兩位美國科學(xué)家Sherwood Gorbach 和Barry Goldin在健康人體腸道中分離得到并 命 名 為 鼠 李 糖 乳 桿 菌（Lactobacillusrhamnosus）[4]，它已流行于全球30多個國家，是目前全球研究最多的益生菌之一。近年來，大量的體外實驗、動物實驗、人體臨床實驗和流行病學(xué)調(diào)查研究充分證明了鼠李糖乳桿菌的安全性和功能性[5]。它具有調(diào)節(jié)腸道的微生態(tài)平衡[6]，緩解腹瀉[7]；定植腸道，增強胃腸道粘膜的屏障功能[8-9]；激活免疫系統(tǒng)，增強免疫能力[10]；消減體內(nèi)毒素[11]；抑制腸道中有害菌群的滋生[12]；預(yù)防齲齒[13]和其他有益的生理功能如能夠治療花粉過敏并加速過敏后的恢復(fù)、預(yù)防便秘、治療急性腸炎等益生作用。因此開發(fā)鼠李糖乳桿菌在益生菌的利用方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

本實驗從家用自然發(fā)酵的泡菜汁中采樣，分離出7株產(chǎn)酸速率高的乳酸菌，并對這7株乳酸菌進行了初步鑒定，對該7株菌的抑菌效果和抗氧化性進行了深入研究，為人工控制發(fā)酵酸菜提供了更多的優(yōu)良菌種，開發(fā)出更多具有重要意義的益生菌。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸菜汁 從自制自然發(fā)酵好的酸菜汁取樣；乳酸菌微量生化鑒定試劑盒和鼠李糖發(fā)酵管 浙江省杭州天和微生物試劑有限公司；硫化氫和硝酸鹽還原實驗單盒生化鑒定管 廣州環(huán)凱微生物科技有限公司；甲酸、對二甲基氨基苯甲醛、正丁醇、標(biāo)準(zhǔn)乳酸、D-木糖、乳糖、D-半乳糖、無水乙醚、鄰苯三酚、鄰二氮菲、30%H2O2、氯化鈉、濃硫酸、硫酸亞鐵等試劑 均為分析純；1.1-二苯基-2-苦基自由基 梯希愛上海化成工業(yè)發(fā)展有限公司；大腸桿菌、蘇云菌桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草桿菌 本實驗室保存；LB培養(yǎng)基[14]，MRS培養(yǎng)基[1，15]。

BW-228WBSV冷凍冷藏箱 青海海爾股份有限公司；LXJ-IIB飛鴿牌系列離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；FC104電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；智能HZQ-FX全溫振蕩培養(yǎng)箱 中國哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；Rowsen PSH-200生化培養(yǎng)箱 中科生命科技股份有限公司；PHSJ-5 pH計上海雷磁儀器廠；微量移液器 北京青云卓立精密設(shè)備有限公司；SW-CJ-1FD單人單面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LGJ18真空冷凍干燥機 北京四環(huán)儀器廠。

1.2 菌株的分離

1.2.1 乳酸菌的富集 按接種量10%將酸菜汁接入MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48h，連續(xù)增殖2~3次。

1.2.2 乳酸菌的初篩 無菌操作下，用移液槍吸取1mL富集液，使用10倍梯度稀釋混菌法（選擇10-3~10-6四個適宜稀釋度的菌液各0.1mL）加入到培養(yǎng)皿中，采用傾注平板法加入已滅菌并冷卻至40℃的含2% CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基，搖勻后于37℃倒置培養(yǎng)48h；挑取各培養(yǎng)基中溶鈣圈較大、長勢較好的單個疑似菌落進一步在MRS固體平板上反復(fù)劃線、純化，直到長出的單菌落大小一致，斜面保存于4℃，備用。

1.2.3 復(fù)篩 將所得到的菌株進行接觸酶反應(yīng)和革蘭氏染色，挑取接觸酶陰性菌株和革蘭氏染色陽性的菌，記錄好菌株編號。

1.2.4 發(fā)酵液中乳酸的定性分析 紙層析法[16]。

1.2.5 不同菌株產(chǎn)酸速率的測定 將不同菌株同時發(fā)酵培養(yǎng)，用pH計分別每隔2h測得發(fā)酵液的pH。

1.3 菌株的鑒定

1.3.1 形態(tài)觀察 將初步分離純化后得到的各菌株轉(zhuǎn)接到MRS固體平板中進行活化，37℃培養(yǎng)48h，觀察菌落形態(tài)，從固體平板上取菌體，進行革蘭氏染色及觀察。

1.3.2 生理生化特征觀察 參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[17]和凌代文[1]《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實驗方法》方法進行。

1.4 生物活性的測定

1.4.1 抑制細(xì)菌 采用牛津杯法，檢測七株乳酸菌對供試細(xì)菌枯草芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌大腸桿菌和蘇云金桿菌的抑菌效果，將分離菌株發(fā)酵培養(yǎng)48h后，分離出菌液上清并5倍濃縮并過濾除菌，各取100μL用于抑菌實驗，用游標(biāo)卡尺檢測抑菌圈直徑。

1.4.2 對羥自由基清除的測定 參照文獻[18]的方法，于試管中依次加入1mL pH7.4 0.15mol/L PBS，1mL 0.75mmol/L鄰二氮菲溶液，0.75mmol/L FeSO4溶液1mL，1mL超純水，1mL不同發(fā)酵樣品，最后加入1mL H2O2，每 加 一 管 立 即 搖 勻 ，反 應(yīng) 液 于 37℃ 保 溫1h，以PBS調(diào)零，在536nm波長處測此加樣管的吸光值。損傷管以超純水代替樣品，以超純水代替樣品及H2O2作為未損傷管，同法測定在536nm波長處的吸光值。清除率計算公式如下：

1.4.3 對DPPH自由基清除的測定 參照文獻[19]的方法，吸取不同發(fā)酵液樣品2mL于試管中，然后加入2mL 0.002%DPPH乙醇溶液，充分混勻，避光靜置30min后，在517nm波長測吸光值為Ai，對照組為2mL樣品與2mL 50%乙醇混合反應(yīng)，517nm處的吸光值記為Aj；空白組為2mL 50%乙醇代替樣品，吸光值記為Ao；50%乙醇作為空白調(diào)零。按以下公式計算清除率。

1.4.4 對超氧陰離子自由基清除的測定 參照文獻[20]中的方法，在試管中加入4.5mL 50mmol/L pH8.2 Tris-HCl緩 沖 液 和5.2mL 超 純 水 混 勻 ，25℃ 水 浴 下保溫20min，取出后立即加入25℃預(yù)熱過的0.3mL 25mmol/L鄰苯三酚，迅速搖勻，倒入比色皿，于325nm每隔30s測定一次吸光值，連續(xù)4min測定鄰苯三酚的自氧化速率。在試管中加入4.5mL 50mmol/L pH8.2 Tris-HCl緩沖液，4.2mL超純水，1mL不同發(fā)酵樣品，混勻，其他步驟同上。按下式計算清除率。

清除率（%）=（A－Ai）/A×100

式中：A：鄰苯三酚的自氧化速率，Ai：加入樣品后鄰苯三酚的自氧化速率，單位均為吸光度每分鐘的增值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定

2.1.1 菌株的形態(tài)特征 從發(fā)酵酸菜中分離到20株菌，其中有13株菌株經(jīng)革蘭氏染色呈陽性，規(guī)則性無芽孢長桿菌，兩端鈍圓，菌落直徑1~2mm，圓形或類圓形、濕潤、邊緣整齊、表面光滑、中央有隆起或扁平的白色或乳白色菌落，不透明、有光澤、質(zhì)地軟，菌落背面為黃色，能溶解CaCO3產(chǎn)生透明圈。如圖1所示。

圖1 菌株的形態(tài)特征Fig.1 The morphological characteristics of the strains

2.1.2 乳酸的定性實驗 經(jīng)紙層析法分析發(fā)酵產(chǎn)物，結(jié)果表明樣品顯色斑點較清晰，無拖尾，分離效果較好，除9號菌斑點較模糊外。標(biāo)樣和各菌株發(fā)酵液的層析點顯色一致，均為黃色斑點，明顯并基本處于同一位置，因而12株菌的發(fā)酵液中均含有乳酸，說明此12株菌均為產(chǎn)乳酸菌株（見圖2）。通過紙層析法測定以上12株菌的發(fā)酵液的Rf值，并與標(biāo)準(zhǔn)乳酸的Rf值進行比較，12株可疑乳酸桿菌發(fā)酵液經(jīng)過紙層析并顯色后，黃色斑點的Rf值與標(biāo)準(zhǔn)乳酸的Rf值相近，且均在允許的誤差范圍內(nèi)（見表1），因而，可以初步確定所分離得到的12株菌株所產(chǎn)酸均為乳酸，即此12株菌均為乳酸菌。

圖2 菌株的乳酸定性紙層析圖Fig.2 The results of the qualitative examination for lactic acid of the bacteria by paper chromatography

表1 標(biāo)準(zhǔn)乳酸與菌株發(fā)酵液紙層析的Rf值比較Table 1 Comparison of the Rfvalues of standard lactic acid and fermentation broth by paper chromatography

圖3 不同菌發(fā)酵液的pH值隨培養(yǎng)時間的變化曲線Fig.3 Change in pH of culture with time

表2 菌種的生化特征及碳水化合物發(fā)酵實驗結(jié)果Table 2 The biochemistry features and the results of carbohydrate fermentation tests of the bacterias

2.1.3 不同菌株的產(chǎn)酸速率 12株產(chǎn)酸菌株24h pH的變化曲線如圖3所示，各菌發(fā)酵液在0~24h內(nèi)pH不斷下降，下降的幅度最大時間段為4～12h，12～24h，各菌的發(fā)酵液下降趨勢變緩，從圖3可以看出，其中4、6、8、10、11、12、13號菌株在24h內(nèi)產(chǎn)酸速率的曲線大致在同一曲線上，產(chǎn)酸速率接近，并且高于其他5株菌，因此在以下實驗中采用這七株菌繼續(xù)做實驗，且分別命名為LR4、LR6、LR8、LR10、LR11、LR12、LR13。

2.1.4 生理生化特征 由表2可知，分離純化后得到的7株菌的生化特性基本一致，均為同型發(fā)酵，其過氧化氫酶實驗、吲哚實驗、水解淀粉實驗、硝酸鹽還原實驗、明膠液化實驗、硫化氫產(chǎn)生實驗、發(fā)酵產(chǎn)氣實驗均為陰性，符合乳桿菌屬的特征，所以初步判定其均為乳桿菌屬。同時，7株菌均能發(fā)酵七葉靈、乳糖、半乳糖、葡萄糖、麥芽糖、纖維二糖、蔗糖、鼠李糖、山梨醇、水楊酸、甘露醇，不發(fā)酵木糖。根據(jù)以上生理生化及糖發(fā)酵鑒定結(jié)果，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14]、《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》第八版和凌代文[1]《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實驗方法》對各菌株進行鑒定，可初步鑒定7株菌均為鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）。一般從自然發(fā)酵酸菜中分離的乳酸菌有各種類型乳桿菌，如彎曲乳桿菌、清酒乳桿菌、干酪乳桿菌、短乳桿菌、棒狀乳桿菌、植物乳桿菌、米酒乳桿菌、羅伊氏乳桿菌和植物乳酸桿菌等[21-22]，而對于從自然發(fā)酵酸菜中分離出鼠李糖乳桿菌尚未有之，這一發(fā)現(xiàn)可為工業(yè)發(fā)酵酸菜提供新的菌種資源。

表3 發(fā)酵液對供試菌的抑菌結(jié)果Table 3 Inhibitory effect of culture filtrate on pathogenic microorganisms

2.2 乳酸菌發(fā)酵液生物活性的測定

2.2.1 抑制細(xì)菌活性 抑菌結(jié)果表明（表3）7株鼠李糖乳桿菌發(fā)酵48h，既能產(chǎn)生具有抑制革蘭氏陰性菌大腸桿菌，又能產(chǎn)生抑制革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和蘇云桿菌的次生代謝物，除LR6菌發(fā)酵液不能抑制枯草桿菌的生長外，其他6株鼠李糖乳桿菌均能發(fā)酵產(chǎn)生抑制枯草桿菌的次級代謝產(chǎn)物，抑菌效果明顯，直徑大部分超過20mm，乳酸菌能夠產(chǎn)生抑菌次生代謝產(chǎn)物主要是細(xì)菌菌素[23-24]，有機酸、酒精和二氧化碳等，在有氧的條件下乳酸菌還可產(chǎn)生過氧化氫，由于乳酸菌缺乏過氧化氫酶，過氧化氫的蓄積可對一些微生物如金黃色葡萄球菌產(chǎn)生抑制作用[25]。

2.2.2 抗氧化性效果 將鼠李糖乳桿菌發(fā)酵液上清離心，真空冷凍干燥濃縮5倍，0.22μm濾膜過濾除菌得發(fā)酵濃縮液，圖4表明7株鼠李糖乳桿菌發(fā)酵液對·OH、DPPH·和O2·-自由基均有顯著的清除作用，但是同種鼠李糖乳桿菌不同型號的菌株，清除自由基的能力還是有差異，其中LR6鼠李糖乳桿菌的清除自由基的能力明顯低于其他6株菌，本研究結(jié)果與王玉華等[26]的研究相似，其研究表明，2.5mL鼠李糖乳桿菌的培養(yǎng)物對羥自由基和超氧陰離能達到50%以上，在本實驗中，除LR6外，1mL的5倍濃縮發(fā)酵液清除·OH和O2·-的能力均超過50%的清除率。

圖4 鼠李糖乳酸菌發(fā)酵液對自由基的清除Fig.4 The scavenging of Rhamnose lactobacillus fermented liquid for free radicals

3 結(jié)論

從自制發(fā)酵酸菜汁中分離出20株菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、菌株液體培養(yǎng)特征和生理生化特征初步鑒定后，發(fā)現(xiàn)有7株菌初步確定為鼠李糖乳桿 菌（Lactobacillus rhamnosus）。但是如果要確定到種，還需做進一步的分子鑒定。

7株菌經(jīng)48h發(fā)酵，均能產(chǎn)生抑制大腸桿菌，金黃色葡萄球菌和蘇云桿菌生長的次生代謝物，LR6菌的發(fā)酵液不能抑制枯草桿菌的生長，其他6株鼠李糖乳桿菌發(fā)酵48h還可產(chǎn)生抑制枯草桿菌的次級代謝產(chǎn)物。從7株菌的抑菌實驗結(jié)果可以看出，這7株菌對于病原菌的清除作用顯著，有利控制發(fā)酵酸菜中的病原菌，對于酸菜的品質(zhì)能起到一定的安全保證作用。

7株鼠李糖乳桿菌發(fā)酵液中能顯著清除·OH、DPPH·和O2-·，由此可以推出7株菌發(fā)酵產(chǎn)生的胞外產(chǎn)物含有清除自由基的有效成分，但其具體成分尚有待進一步的研究。

7株鼠李糖乳桿菌的生物活性研究結(jié)果表明該7株菌是性能非常優(yōu)良的乳酸菌，值得開發(fā)和利用。

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Isolation，identification and characterization of Lactobacillus rhamnosus strains from pickle during natural fermentation

ZHOU Xian-jiao1，2，RAO Ying-zhu1，2，*，HUANG Ting-juan1，CHEN Rong1，2
（1.Life Science and Technology School，Lingnan Normal University，Zhanjiang 524048，China；2.Institute of Applied Biotenology Lingnan Normal University，Zhanjiang 524048，China）

20 bacterias were isolated from pckle during natural fermentation.12 of them were gram-positive bacterias，7 of these gram-positive bacterias were catalogued as Lactobacillus rhamnosus strains by testing producing lactic acid，the rate of producing the acid，the physiological and biochemical characteristics.It was also studied that the antimicrobial was assayed by the oxford cup and the anti-oxidation abilities were tesed by the scavenging the ·OH，DPPH· and O2·-of Rhamnose lactobacillus fermented liquid.The results showed as follows：these 7 Lactobacillus rhamnosus strains have antibacterial activity against Escherichia coli，Su Yunjun Bacillus and Staphylococcus aureus.Except LR6 Lactobacillus rhamnosus strain，they also could inhibit Bacillus subtillis，the Rhamnose lactobacillus fermented liquid could scaveng the ·OH，DPPH· and O2·-free radicals obviously.

sauerkraut；Lactic acid bacteria；antimicrobial；anti-oxidation

TS201.2

A

1002-0306（2014）22-0199-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.035

2014－03－11

周鮮嬌（1976-）女，碩士研究生，實驗師，研究方向：海洋微生物。

* 通訊作者：饒穎竹（1968-），男，博士，副教授，研究方向：海洋生物學(xué)。

國家星火計劃項目（2012GA780023）；國家星火計劃引導(dǎo)項目（2013GA780091）。