淺談透射電鏡生物樣品取材實驗課的體會

范曉燕，林方興，湯 瑩，楊勇驥

（第二軍醫(yī)大學 基礎部生物物理學教研室暨電鏡中心，上海 200433）

電子顯微鏡從誕生之日起就受到世人矚目，經(jīng)過七十多年的發(fā)展，電子顯微鏡技術現(xiàn)已廣泛應用于各科研、醫(yī)學領域，對科研的發(fā)展及疾病的治療做出了極為重要的貢獻。電鏡室的工作人員主要負責電鏡制樣及觀察工作，但是取材必須是由研究生和科研人員親自操作，標本取好、固定后送至電鏡室。在生物樣品的取材過程中容易出現(xiàn)的問題最多，取材不當，會直接影響到實驗結果，因此，取材是整個樣品制備過程中的關鍵步驟之一。作為一名電鏡實驗室的教師，指導學生正確取材的方法及培養(yǎng)學生動手操作的能力是尤為重要的。

1 取材實驗前的準備工作

1.1 實驗設計

由于透射電鏡實驗所用試劑昂貴，費用較大，實驗周期相對較長，因此，周全的實驗設計是必不可少的。在實驗設計中，實驗者首先需要明確實驗目的，然后選擇合適的實驗動物及試劑，備齊實驗器具，合理安排實驗流程，并做好預實驗工作，以檢驗實驗設計的科學性。實驗時，還必須嚴格設立對照組。不僅要有正常對照，有時還應設立和實驗組相同條件的對照。實驗組和對照組的動物必須在相同條件下取材，在時間上盡量同步，采用相同的緩沖和固定液，取材部位完全相同，以增加實驗的可靠性。此外，各組實驗動物還應該具有一定的數(shù)量，得出的結論才較為可靠及有利于統(tǒng)計學分析［1］。

1.2 器械及試劑的準備

取材前應準備好實驗器械及試劑：直彎剪各一把、大小鑷子各一把、止血鉗若干、雙面刀片、卡片紙或玻璃皿、冰臺、青霉素小瓶、各種預冷的緩沖液及固定液等。

不同的電鏡技術所需試劑是不同的。如緩沖液的使用，常規(guī)電鏡技術一般使用磷酸緩沖液；電鏡細胞化學技術和免疫電鏡技術一般使用二甲砷酸鹽緩沖液［2］。

1.3 實驗動物的準備

根據(jù)實驗目的選擇合適的實驗動物，并在有資格認定的部門購買，同時應飼養(yǎng)在和其品級相應條件的環(huán)境下，否則實驗結果可能得不到承認。實驗動物還應避免從遠處運來因外界環(huán)境因素的改變而發(fā)生的生理狀態(tài)的變化。

2 取材時的注意事項

2.1 取材的要點

取材是電鏡生物樣品制備的第一步，也是十分重要的一步。為了保證取材位置的準確性，取材必須由每個實驗者親自操作。取材時需要注意的要點是：快、冷、小、凈、準、避免機械損傷［2］。

快：取材應在實驗動物血流還未停止時就快速取材。因為組織一旦缺血，細胞就會處于缺氧狀態(tài)，細胞內(nèi)的溶酶體會釋放一些酶使細胞自溶，從而破壞細胞的超微結構。因此，組織一旦離體就應立刻固定。最好在1min之內(nèi)浸泡于固定液中。

冷：為了降低酶活性，減少細胞自溶，取材的環(huán)境溫度應盡量保持低溫。組織離體后，需在冰臺上切小塊，冰臺上需覆蓋一層厚卡紙或玻璃皿，以避免組織與冰直接接觸，造成冰晶的形成，影響后續(xù)電鏡觀察。操作時所用固定液和緩沖液需要預冷為4°。

?。河捎诠潭ㄒ簼B透速度緩慢的影響，組織塊需切成小于1mm3的立方體小塊或截面為1mm2長方體。通常情況下，無方向性的組織，如肝臟、腎臟、肺臟等，切成立方體小塊，有方向性的組織，如皮膚、腸、神經(jīng)、肌肉等，切成長方體小塊。

凈：盡量避免將血液或組織液帶入固定液中，影響固定液的濃度及Ph值。沖洗組織塊可用緩沖液或生理鹽水，忌用自來水直接沖洗。

準：取材部位一定要精確。電鏡制樣要求組織塊很小，電鏡觀察的視野更小，因此，要根據(jù)需要觀察的內(nèi)容，選擇具體的取材部位。比如腎臟中皮質(zhì)和髓質(zhì)的超微結構是不同的，若要觀察腎小球的結構就必須取皮質(zhì)部分的組織。

避免機械損傷：取材時，動作要輕柔，刀片要鋒利，切割時避免來回牽拉，以防止發(fā)生機械損傷。避免由于人為因素造成的實驗結果的假象。

2.2 取材的具體過程

將預冷的固定液滴在冰臺上的卡紙或玻璃皿上，將實驗動物進行麻醉或頸椎脫臼。打開胸腔或腹腔，暴露所需器官，在血流未完全停止前剪取需要的組織塊，用預冷的緩沖液或生理鹽水將血液及組織液沖洗凈，迅速放在卡紙或玻璃皿上的固定液中，用雙面刀片將剪刀和鑷子剪過或夾過的部分切掉，然后按要求切成小塊移入裝有固定液的小瓶中，貼好標簽，置于4°保存。一些特殊樣品的取材方法：如腦、脊髓、視網(wǎng)膜組織需要灌流固定后再取材；懸浮細胞及菌類收集到離心管中，以1500rpm／min的速度離心5min，然后加入固定液重懸后4°固定；在收集貼壁培養(yǎng)細胞時，如使用胰酶消化細胞，將會使細胞鏈打開，細胞骨架將會發(fā)生改變。因此需使用細胞刮子將細胞輕輕從培養(yǎng)皿中刮下后，用吸管收集到離心管中進行固定。

3 提高學生的學習興趣和培養(yǎng)學生的動手能力

通過帶領學生參觀實驗室，觀摩了解醫(yī)學生物樣品的前期準備、中期制備、后期觀察等一系列的電鏡生物樣品制備過程；鼓勵學生課后多查文獻，而后組織學生在帶教教師的指導下，開展實踐性的實驗課，自己動手，進行實際操作，增強學生的感性認知。最后，小組間學生相互討論，系統(tǒng)總結。實驗操作中的真實感受可使學生興趣大增，而且看到了生物電子顯微鏡相關研究的廣闊應用前景，更能夠激發(fā)學生強烈的探索欲望［3］。

科研離不開實驗，對于實驗者來說，動手能力更是不可缺少的素質(zhì)之一。動手能力不只是實驗操作能力，還包括對所用實驗方法及儀器的原理的掌握、實驗方案的設計等能力。理解掌握實驗方法的原理和所用儀器的原理是最基本的，只有熟悉這些原理，才能更好地進行實驗操作，更靈活地使用儀器，甚至更好地開發(fā)儀器的功能。設計實驗方案，不斷完善實驗方案，這些工作也有助于不斷強化動手能力［4］。由于電鏡生物樣品取材所包含的操作技能特別多，要求又特別精細。為了真正做到培養(yǎng)學生的實驗操作技能，實驗課應讓他們?nèi)巳藙邮郑瑐€個過程都要參與體會。在實驗過程中，教師要求學生邊解剖邊思考不同的組織器官在取材時的特點及存在的差別。讓學生在問題中尋找答案，在思考中進行動手操作。每到取材的關鍵之處，教師要給與精心指導，并嚴格把關。在實驗操作過程中，出現(xiàn)的錯誤都必須及時給予糾正?？偨Y出在取材過程中出現(xiàn)的一些問題，及解決問題的方案。

4 提高教師的業(yè)務素質(zhì)及指導水平

教師的業(yè)務素質(zhì)和指導水平對于學生的培養(yǎng)起著不可忽視的作用。因此，教師需要不斷地學習新知識、新技術，不斷地完善自己的知識結構。教師自我素質(zhì)的提高、知識更新，有利于提高教學質(zhì)量，培養(yǎng)高素質(zhì)的醫(yī)學人才。在實驗課教學時，一位優(yōu)秀的教師除了自己具備較強的技術操作能力外，還要注意加強指導能力和方法的訓練［4］。在指導學生取材時，要因材施教，做到以學生為主，鼓勵學生主動思考，教師從旁協(xié)助，在關鍵地方給予引導。

總之，生物樣品的取材是透射電鏡樣品制備的第一步，標本的質(zhì)量好壞，直接影響到電鏡觀察的效果和臨床病理診斷的正確性。如果實驗者設計不合理，操作不規(guī)范，將直接導致后續(xù)實驗工作是徒勞的，并造成實驗費用和時間上的浪費。因此在實驗教學中，教師應注重把學生的能力培養(yǎng)放在首位，樹立嚴謹?shù)目茖W態(tài)度，提高每位學生的動手能力，掌握取材的正確方法，才能做到萬無一失，達到預期的實驗效果。

［1］曲淑賢，呂廣艷，高船舟，等.指導研究生電鏡取材的體會［J］.醫(yī)學信息，2010，23（1）：48－49.

［2］楊勇驥.醫(yī)學生物電子顯微鏡技術［M］.上海：第二軍醫(yī)大學出版社，2012：73－75.

［3］晉若冰，湯 瑩，范曉燕，等.生物醫(yī)學電鏡技術實驗課教學初探［J］.解剖學雜志，2012，35（6）853－854.

［4］湯 瑩，金 嬋，沈亞峰，等.淺談生物技術專業(yè)本科生科研能力的培養(yǎng)［J］.西北醫(yī)學教育，2011，19（3）469－470.