RNA干擾技術(shù)在端粒酶抑制劑中的應(yīng)用

徐小彬(綜述)，譚 晶(審校)

(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽胰外科，昆明 650101)

RNA干擾是一種外源性雙鏈RNA抑制細(xì)胞內(nèi)同源基因表達(dá)的現(xiàn)象，通過外源性雙鏈RNA在mRNA水平關(guān)閉相應(yīng)序列及基因表達(dá)使目的基因沉默，這是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默。RNA干擾具有高效、特異、快速的特點(diǎn)，其在腫瘤基因治療領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。

端粒酶具有特殊的結(jié)構(gòu)和功能，其激活與惡性腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。端粒酶抑制劑被認(rèn)為是一類潛在的高選擇性的抗癌藥物，抑制劑的研究為惡性腫瘤的早期診斷和基因治療開辟了新途徑。

目前以抑制端粒酶活性為靶點(diǎn)的惡性腫瘤治療方案不斷出現(xiàn)，盡管作用的環(huán)節(jié)各不相同，但都是以抑制端粒酶活性為目的。

1 端粒、端粒酶與腫瘤的關(guān)系

1.1端粒的特殊作用 端粒是真核細(xì)胞染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)，其生物學(xué)作用是維持染色體穩(wěn)定，保證染色體DNA完全復(fù)制，阻止遺傳信息丟失，維持基因組完整，防止染色體末端彼此黏著，參與染色體在核內(nèi)的空間分布。端粒長度是決定細(xì)胞增殖能力與壽命的分子標(biāo)志[1]。

1.2端粒酶的活性 人端粒酶是一種核糖核蛋白復(fù)合物，由人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)、人端粒酶RNA組分(human telomerase RNA，hTR)以及人端粒酶相關(guān)蛋白1(telomerase associated protein 1，TEP1)組成。端粒酶利用其自身hTR所攜帶的RNA為模板，在hTERT的逆轉(zhuǎn)錄催化下，將端粒重復(fù)序列合成到染色體末端。TEP1主要功能是調(diào)節(jié)端粒酶的活性[2]，它含有與端粒DNA互補(bǔ)的RNA模板，可以結(jié)合在端粒DNA上，通過使有轉(zhuǎn)錄活性的蛋白部分延伸，從而解決了真核細(xì)胞分裂中的末端復(fù)制問題，維持端粒的長度[3]。

1.3端粒酶與腫瘤的關(guān)系 端粒酶的激活與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，在80%～90%的人原發(fā)腫瘤和腫瘤細(xì)胞系中可檢測出端粒酶活性(如前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、肝癌、肉瘤等)，而在正常人體組織中卻無表達(dá)(除生殖細(xì)胞、一些淋巴細(xì)胞和造血干細(xì)胞外)[4]。1994年Kim等[5]利用端粒重復(fù)擴(kuò)增法(telomeric repeat amplification protocol,TRAP)檢測了101種腫瘤標(biāo)本和100個獨(dú)立的永生細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)90種腫瘤標(biāo)本和98個永生細(xì)胞系中有端粒酶活性，而在良性腫瘤及正常體細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)端粒酶活性。Hiyarma等[6]采用TRAP檢測胰腺癌標(biāo)本的端粒酶活性，發(fā)現(xiàn)43例中有41例呈現(xiàn)陽性，而11例胰腺良性腫瘤標(biāo)本均為陰性。葉遠(yuǎn)紅等[7]檢測胰腺癌患者胰液中的端粒酶活性，結(jié)果31例胰腺癌患者中19例端粒酶活性陽性，3例胰腺良性腫瘤患者中有1例端粒酶活性陽性，6例非胰腺疾病患者中端粒酶活性均為陰性。鐘英強(qiáng)等[8]應(yīng)用鏈霉親和素-生物素復(fù)合物法(strept avidin-biotin complex,SABC)檢測38例胰腺癌、25例胰腺炎、20例正常胰腺組織中hTERT的表達(dá)，結(jié)果顯示正常胰腺組織及慢性胰腺炎組織中hTERT不表達(dá)。許元鴻等[9]研究的39例胰腺癌中，36例端粒酶表達(dá)陽性，11例胰腺良性病變均未檢出端粒酶的陽性表達(dá)。因此，端粒酶重新激活是癌變細(xì)胞一個帶有普遍性意義的生物學(xué)標(biāo)志，被認(rèn)為是細(xì)胞癌變的一個重要細(xì)胞生物學(xué)異常事件，是細(xì)胞永生化及腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵步驟[10]。

2 RNA干擾的特點(diǎn)

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中伴隨多種基因的異常，這些異常表達(dá)基因的蛋白產(chǎn)物與正常組織細(xì)胞的同類蛋白并無差異[11]，因此在蛋白水平不能很好地區(qū)分正常細(xì)胞與惡性腫瘤細(xì)胞。基因變異往往反映在mRNA水平上，這就使RNA干擾技術(shù)得以應(yīng)用。

2.1RNA干擾的作用機(jī)制 RNA干擾機(jī)制的特性在于外源性雙鏈RNA的引發(fā)及細(xì)小干擾RNA(small interference RNA,siRNA)的引導(dǎo)干擾作用。

整個過程首先是在ATP存在的條件下，外源性雙鏈RNA通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，由胞質(zhì)的Dicer酶切割為21～23 bp的siRNA，隨后siRNA與具有核酸內(nèi)切酶活性的Argonaute2等[12]蛋白酶結(jié)合，形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物。此復(fù)合物可以把攜帶的雙鏈siRNA變成單鏈siRNA。含單鏈siRNA的沉默復(fù)合物具有活性，可與目的mRNA結(jié)合，導(dǎo)致目的mRNA斷裂、降解，從而導(dǎo)致目的基因沉默。

2.2RNA干擾與腫瘤的關(guān)系 腫瘤的發(fā)生、發(fā)展不但涉及原癌基因的激活，也與抑癌基因的失活密切相關(guān)。原癌基因包括腫瘤血管生成因子[13](血小板源性生長因子、表皮生長因子受體及血管內(nèi)皮生長因子)、Ras相關(guān)蛋白[14]、端粒酶重要組成成分(hTERT、hTR及TEP1)等。抑癌基因包括野生型P53抑制基因、細(xì)胞周期蛋白B1調(diào)控亞基、凋亡抑制蛋白、Bcl家族促凋亡基因、浸潤和轉(zhuǎn)移調(diào)控基因黏著斑激酶、Ezrin蛋白、免疫抑制因子等[15-21]。理論上，腫瘤整個發(fā)生、發(fā)展過程中所涉及的基因或蛋白都可以成為RNA干擾的靶點(diǎn)，以此基因或蛋白設(shè)計(jì)出的siRNA可靶向沉默其表達(dá)，從而達(dá)到抑制腫瘤生長或促進(jìn)細(xì)胞凋亡的目的。

3 RNA干擾與端粒酶抑制劑

端粒酶抑制劑類抗腫瘤藥的設(shè)計(jì)主要以hTERT、hTR以及TEP1為對象。這一類生物制劑中，以端粒酶hTERT和hTR與腫瘤關(guān)系最為密切，也是腫瘤反義藥物的主要靶點(diǎn)。

3.1以端粒酶hTERT為靶點(diǎn)的抑制劑 hTERT基因與腫瘤關(guān)系最為密切。研究表明，hTERT是調(diào)節(jié)端粒酶活性的決定性因素[22]。利用端粒酶hTERT啟動子靶向基因治療可選擇性地殺死端粒酶陽性的腫瘤細(xì)胞。

丁昂等[23]研究hTERT-siRNA對人膽囊癌細(xì)胞(GBC-SD細(xì)胞)代謝、侵襲及端粒酶活性的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，抑制hTERT基因的表達(dá)可同時(shí)降低端粒酶活性。宋玉姣等[24]通過設(shè)計(jì)的Ad-VEGF-shTERT重組腺病毒質(zhì)粒，能顯著抑制端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的表達(dá)，通過抑制端粒酶的活性，抑制鼻咽癌CNE-2細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。在前期試驗(yàn)中設(shè)計(jì)的重組質(zhì)粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-hTERT-siRNA通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞Panc-1，從體內(nèi)和體外整體水平上證實(shí)了siRNA下調(diào)hTERT的表達(dá)，體現(xiàn)出良好的RNA干擾沉默效應(yīng)，并且也證實(shí)了其對胰腺癌細(xì)胞有抑制生長、促進(jìn)凋亡的作用。

腺病毒攜帶的質(zhì)粒能方便聚集于腫瘤細(xì)胞而對正常細(xì)胞無影響，提高了病毒對腫瘤殺傷的特異性[25]。不管是腺病毒還是脂質(zhì)體攜帶hTERT-siRNA都對正常細(xì)胞無影響，針對siRNA的多種方法攜帶進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)而起到沉默效應(yīng)，載體的選擇上可能與研究的細(xì)胞系的特異性以及試驗(yàn)差異性有關(guān)。

3.2以端粒酶hTR為靶點(diǎn)抑制劑 hTR是構(gòu)成端粒酶的重要結(jié)構(gòu)，因此通過特異性封閉其活性區(qū)域，可以抑制hTR活性，阻斷其轉(zhuǎn)錄或翻譯過程，達(dá)到降低端粒酶的活性的目的[26]。李燕等[27]構(gòu)建腺病毒Ad-hTR-siRNA可以有效、特異地抑制hTR基因表達(dá)，誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的HeLa腫瘤細(xì)胞凋亡，具有抗腫瘤活性。李婉宜等[28]將設(shè)計(jì)的hTR-siRNA腺病毒注入宮頸癌移植瘤，發(fā)現(xiàn)腺病毒能夠顯著抑制裸鼠人宮頸癌移植瘤的生長。徐鋒等[29]通過構(gòu)建以hTR基因?yàn)榘悬c(diǎn)的RNA干擾裝置PhTR-siRNA，檢測PhTR-siRNA對BIU-87細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)膀胱尿路上皮癌BIU-87細(xì)胞株的生長及端粒酶活性明顯受到抑制。

3.3以端粒酶TEP1為靶點(diǎn)的抑制劑 端粒酶蛋白亞單位作為一種抑癌基因在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。TEP1及其蛋白抗體是構(gòu)成端粒酶不可缺少的部分，破壞端粒酶蛋白亞的結(jié)構(gòu)使其失活，便可抑制端粒酶活性。研究發(fā)現(xiàn)，TEP1與腫瘤mRNA、血管內(nèi)皮生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)[30]，但是以端粒酶TEP1為靶點(diǎn)的研究報(bào)道較少，原因可能與尚無滿意的人類端粒酶蛋白抗體有關(guān)[31]。

4 結(jié) 語

相對于其他類型的抗腫瘤藥物，腫瘤對于端粒酶抑制劑類不易產(chǎn)生耐藥性，且與傳統(tǒng)化療藥物的細(xì)胞毒性不同，以端粒酶為靶向的藥物可減少對正常細(xì)胞的毒副作用。目前研究已證實(shí)端粒酶抑制劑可與腫瘤的放、化療協(xié)同，增加其治療的敏感性[32-34]。端粒酶基因治療的優(yōu)勢使其有望成為治療的新方案。

并非所有腫瘤細(xì)胞端粒酶的活性都呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，端粒酶抑制劑對端粒酶活性較高、端粒相對較短的腫瘤細(xì)胞可能發(fā)揮更大的作用。某些癌基因家族中的多個基因往往具有同源性很高的保守序列，可以針對這些保守序列設(shè)計(jì)出特異的雙鏈RNA，產(chǎn)生多個基因同時(shí)剔除的表型，理論上可以產(chǎn)生更大的沉默基因表達(dá)效率[35-36]。

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