離子對(duì)色譜法在氨基酸分析中的應(yīng)用*

孫月，李博**，黃潔，王歲樓

中國(guó)藥科大學(xué)1藥學(xué)院，2藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京　210009；3甘肅省食品藥品檢驗(yàn)所，蘭州　730070

離子對(duì)色譜法在氨基酸分析中的應(yīng)用*

孫月1，2，李博1，2**，黃潔3，王歲樓1**

中國(guó)藥科大學(xué)1藥學(xué)院，2藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210009；3甘肅省食品藥品檢驗(yàn)所，蘭州730070

摘要氨基酸分析是食品藥品以及臨床研究中的重要研究領(lǐng)域。相比于傳統(tǒng)方法，離子對(duì)色譜技術(shù)分析氨基酸時(shí)具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度較高，以及可以避免衍生化帶來的分析雜質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)。本文詳細(xì)介紹了離子對(duì)色譜方法的原理、影響因素以及使用全氟羧酸作為離子對(duì)試劑分析氨基酸的優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)，綜述了離子對(duì)色譜法分析氨基酸在食品藥品、臨床診斷檢測(cè)、代謝組學(xué)中的研究進(jìn)展，并對(duì)離子對(duì)色譜法在氨基酸分析中的應(yīng)用進(jìn)展、測(cè)定方法的完善等進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞氨基酸分析；離子對(duì)色譜；應(yīng)用

氨基酸不僅參與蛋白質(zhì)合成，還可調(diào)控基因表達(dá)，與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變、酶活性和離子通量調(diào)節(jié)有關(guān)。氨基酸的分析是研究代謝調(diào)控的重要工具。目前報(bào)道的氨基酸分析方法包括茚三酮比色法、氣相色譜法、柱后衍生高效陽(yáng)離子交換色譜法（HPCEC法，即氨基酸分析儀法）、柱前衍生反相高效液相色譜法和毛細(xì)管電泳法等。其中較為常用的分析方法是衍生反相高效液相色譜法。衍生法雖然具有分離快、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)也具有操作復(fù)雜和影響因素多等缺點(diǎn)[1]。近年來，不需將氨基酸衍生化即可直接分析的離子對(duì)色譜技術(shù)（ion pair chromatography，IPC）得到廣泛應(yīng)用。

本文詳述了離子對(duì)色譜方法分析氨基酸的特點(diǎn)以及離子對(duì)色譜條件的選擇，綜述了離子對(duì)色譜法分析氨基酸在藥品分析、臨床診斷檢測(cè)、代謝組學(xué)中的研究進(jìn)展，并針對(duì)其應(yīng)用的發(fā)展以及測(cè)定方法的完善等進(jìn)行了展望。

1　反相離子對(duì)色譜法

離子對(duì)色譜法分為正相離子對(duì)色譜法和反相離子對(duì)色譜法，其中應(yīng)用較廣的是反相離子對(duì)色譜法（reversed phase ion pair chromatography，IP-RPIC）。反相離子對(duì)色譜法無需衍生或使用特殊色譜柱[2]，還具有反相色譜法操作簡(jiǎn)便和分離柱效高等固有優(yōu)點(diǎn)[3]，使其成為目前氨基酸分析最常用的方法。其與MS/MS技術(shù)聯(lián)用以分析復(fù)雜樣品中的氨基酸具有高靈敏度和高選擇性，常用于痕量氨基酸的測(cè)定[2]。

2　離子對(duì)色譜條件的選擇

2.1氨基酸分析中常用離子對(duì)試劑

在IP-RPIC中，由于氨基酸的兼性離子特性，氨基酸離子化的羧基和氨基分別與陽(yáng)離子和陰離子表面活性劑結(jié)合形成離子對(duì)。目前陰離子表面活性劑被普遍應(yīng)用，例如烷基磺酸鹽，常用的有正戊磺酸鈉、正己磺酸鈉、正庚磺酸鈉等[1-2]。相比于它而言，全氟羧酸具有較低表面能、沸點(diǎn)更低等特點(diǎn)，因此更適合ELSD或MS檢測(cè)器。常用的全氟羧酸有三氟乙酸（TFA）、七氟丁酸（HFBA）、九氟戊酸（NFPA）、十三氟庚酸（TDFHA）和全氟辛酸（PDFOA）等。

TFA由于其高純度、高水溶性以及在220 nm處的高通透性，使得它成為用于未衍生氨基酸分離的最常用揮發(fā)性離子對(duì)試劑，但是它在對(duì)強(qiáng)極性氨基酸檢測(cè)時(shí)靈敏度低，選擇性差[4]。較長(zhǎng)碳鏈的全氟羧酸已經(jīng)成為比TFA更好的選擇[2]，HFBA被更多地用于離子對(duì)色譜分析氨基酸的研究中，能進(jìn)一步增加保留時(shí)間[4]。Kwon等[5]比較了兩種離子對(duì)試劑（HFBA、NFPA）的分離效果，實(shí)驗(yàn)表明NFPA的分離效果更好，同時(shí)具有質(zhì)譜檢測(cè)器背景噪音小等優(yōu)點(diǎn)，更適合氨基酸質(zhì)譜分析。Petritis等[4]比較了五種全氟羧酸（TFA、HFBA、NFPA、TDFHA和PDFOA）的氨基酸分析效果。對(duì)平衡時(shí)間、離子對(duì)試劑的性質(zhì)等幾個(gè)參數(shù)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明TFA的平衡時(shí)間正比于死時(shí)間，在多孔石墨碳填料柱（PGC）表面沒有吸附，HFBA和NFBA的平衡時(shí)間也基本可以忽略。而TDFHA或PDFOA會(huì)大量吸附在多孔石墨碳表面，且形成一個(gè)近似動(dòng)態(tài)離子交換模型的系統(tǒng)?？梢钥闯?，隨著全氟羧酸碳鏈長(zhǎng)度的增加，其保留量也逐漸增大。

2.2離子對(duì)試劑濃度

Harder等[6]在建立定量分析血漿中22種氨基酸的方法時(shí)，采用含有0.5 mmol·L-1HFBA的流動(dòng)相。Kwon等[5]研究發(fā)現(xiàn)NFPA的最佳選擇性表現(xiàn)在濃度為20 mmol·L-1～25 mmol·L-1的范圍內(nèi)，濃度再高，保留趨勢(shì)和效率反而會(huì)降低。Petritis等[4]證實(shí)碳鏈最長(zhǎng)的PDFOA（5 mmol·L-1）是經(jīng)典RP柱上最合適的離子對(duì)試劑，其濃度提高后選擇性并沒有提高，具有同樣情況的還有TDFHA。

2.3流動(dòng)相pH

Aruda等[7]測(cè)量了各種濃度的PDFOA水溶液pH為：0.01%，pH值4.4；0.02%，pH值3.1；0.06%，pH值2.9和0.08%，pH值2.8。為了進(jìn)行比較，Kotrebai等[8]報(bào)道了0.1%TFA水溶液，pH值2.05以及0.1%HFBA，pH值為2.55，可以根據(jù)色譜柱的pH耐受范圍，以及氨基酸分離效果來選擇合適的全氟羧酸溶液作為流動(dòng)相。

2.4色譜柱

目前離子對(duì)色譜技術(shù)分析氨基酸最常用的色譜柱是經(jīng)典反相C18柱。Petritis等[4]采用了兩種基于高純度硅膠的新生代色譜柱（Purospher RP-18e和Supelcosil ABZ＋Plus）和一種適于分析極性化合物的色譜柱（LiChrospher RP-Select B）并進(jìn)行研究，比較了這三種反相柱分離10種較難分離的未衍生氨基酸的分析情況，Purospher RP-18e柱的最佳離子對(duì)試劑條件是0.5 mmol·L-1的PDFOA，其它兩根色譜柱是在0.75 mmol·L-1的PDFOA的條件下分離最優(yōu)。這是因?yàn)镻urospher RP-18e柱的固定相疏水性最強(qiáng)，具有最高的保留因子值，在任何情況下Purospher RP-18e柱都能得到最好的分離結(jié)果。Chaimbault等[9]為提高難分離氨基酸的分離度，使用多孔石墨碳柱（PGC）進(jìn)行分析，與傳統(tǒng)填料的反相色譜柱相比，這種柱子的固定相由不含殘留硅醇基的剛性二維平面狀碳片組成，其疏水性大大強(qiáng)于經(jīng)典反相色譜柱材料，由于石墨的離域π-電子也在保留機(jī)制中起作用，因此極其適合極性化合物的分析。此外，多孔石墨碳也比二氧化硅更能耐受全氟羧酸離子對(duì)試劑帶來的酸水解問題。他們使用PGC柱在正離子模式下，優(yōu)化了液相色譜串聯(lián)離子噴霧質(zhì)譜分析20種氨基酸的質(zhì)譜條件。在NFPA作為離子對(duì)試劑的條件下，首次在20 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了氨基酸的完全分離，因此PGC在分析未衍生氨基酸的反相填料選擇中具有很大潛力。

2.5檢測(cè)器

目前離子對(duì)色譜中使用最多的檢測(cè)器是蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（evaporative light scattering detection，ELSD）和質(zhì)譜檢測(cè)器（mass spectrumdetector，MS）。

2.5.1ELSDELSD的優(yōu)點(diǎn)在于進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，流動(dòng)相完全揮發(fā)，基線非常平穩(wěn)。王玉紅[10]用這種檢測(cè)器對(duì)20種基本氨基酸進(jìn)行了定量分析，有消除溶劑影響的優(yōu)點(diǎn)。

但使用ELSD作為檢測(cè)器時(shí)也存在諸如溫度可能會(huì)影響全氟羧酸的物理形態(tài)而影響檢測(cè)過程的問題，如PDFOA在室溫下為固體，但Petritis等[4]證明用ELSD檢測(cè)時(shí)，PDFOA具有足夠的揮發(fā)性而不增加背景噪聲。再如ELSD靈敏度不高、在梯度洗脫時(shí)出現(xiàn)的共流物或誘導(dǎo)峰可能會(huì)掩蓋一些氨基酸等問題[5]，因此MS檢測(cè)器的使用就非常必要。

2.5.2MS與ELSD檢測(cè)器相比，MS的靈敏度較高。它能檢測(cè)共流的氨基酸，專屬性更好，因此更適合復(fù)雜基質(zhì)中的氨基酸含量分析。

質(zhì)譜流動(dòng)相中不能加入非揮發(fā)性添加劑，因此限制了部分離子對(duì)試劑的使用。質(zhì)譜中常用的陽(yáng)離子對(duì)試劑有庚胺、二丁胺、三丙胺等[11]，而常用的陰離子試劑全氟羧酸也為極性分析物種類的日益多樣化提供良好的MS檢測(cè)器兼容性。相關(guān)報(bào)道中，約有一半是采用全氟羧酸作為離子對(duì)試劑[7]。例如，Orioli等[12]用采用LC-MS/MS法分析肥胖鼠尿液中組氨酸和含組氨酸肽的脂質(zhì)衍生的羰基應(yīng)激的尿液生物標(biāo)志物，檢測(cè)限達(dá)到0.01 nmol·mL-1～0.075 nmol·mL-1。該研究以5 mmol·L-1的NFPA為離子對(duì)試劑，將基質(zhì)成分以外的分析物轉(zhuǎn)化成親脂性更強(qiáng)的物質(zhì)，這為今后同時(shí)分析復(fù)雜樣品中的氨基酸提供了新思路。

質(zhì)譜用于離子對(duì)色譜技術(shù)分析氨基酸，雖然具有靈敏度高、樣品用量少、分析速度快等優(yōu)勢(shì)，但也存在離子對(duì)試劑干擾問題。近期相關(guān)報(bào)道中約有三分之一提到了離子對(duì)試劑對(duì)MS的電離抑制現(xiàn)象，在氨基酸等極性物質(zhì)分析中出現(xiàn)的電離抑制占總量的28%[7]。如短碳鏈的全氟羧酸三氟乙酸，會(huì)嚴(yán)重抑制MS信號(hào)[13]。而長(zhǎng)碳鏈全氟羧酸由于其揮發(fā)性較差，使用時(shí)會(huì)污染離子源[14]。Le等[15]針對(duì)全氟羧酸離子對(duì)試劑干擾問題建立了一種快速、高靈敏度、強(qiáng)特異性以及可以與結(jié)構(gòu)異構(gòu)體有良好分離的LC-MS/MS法，定量分析33種未衍生氨基酸，樣品采用TDFHA稀釋并使用兩根色譜柱進(jìn)行氨基酸的分離，可以去除雜質(zhì)的干擾并且減少離子抑制現(xiàn)象，相比其它氨基酸分析方法更為先進(jìn)。

為了保持色譜分離的有效性，避免ESI條件下強(qiáng)酸使電性中和導(dǎo)致靈敏度的損失，可以采用對(duì)溶液離子化不敏感的大氣壓電離技術(shù)。使用HFBA作為離子對(duì)試劑的色譜技術(shù)與大氣壓離子化相結(jié)合應(yīng)用于氨基酸的分析，可能成為HPLC-MS分析氨基酸的一個(gè)發(fā)展方向。近期，有人提出微波誘導(dǎo)等離子體離子化（MIPI）源作為可選擇的大氣壓電離技術(shù)應(yīng)用于質(zhì)譜，它能夠在較大流速范圍內(nèi)保持高靈敏度。Kwon等[5]在使用TFA和NFPA作為離子對(duì)試劑分析未衍生氨基酸時(shí)，比較了ESI、APCI以及MIPI離子源的靈敏度。其中對(duì)MIPI-MS和ESI-MS進(jìn)行比較時(shí)發(fā)現(xiàn)，由于液相中的質(zhì)子化分析物與強(qiáng)陰離子對(duì)試劑（TFA、NFPA）間發(fā)生電荷中和，ESIMS的信號(hào)強(qiáng)度顯著降低，而MIPI-MS的信號(hào)強(qiáng)度主要取決于分析物與質(zhì)子化試劑間的碰撞速度、分析物的氣化性質(zhì)和質(zhì)子化試劑的理化性質(zhì)等氣化過程中發(fā)生的變化，因此其信號(hào)強(qiáng)度受TFA和NFPA的影響不大，因此HPLC/MIPI-MS技術(shù)可能具有更廣泛的使用空間。

3　反相離子對(duì)色譜在氨基酸分析中的應(yīng)用

3.1代謝組學(xué)

氨基酸作為代謝組學(xué)所分析的代謝指標(biāo)之一，需要滿足高靈敏度、高通量、無偏性的分析要求，離子對(duì)色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析氨基酸無需衍生化和高靈敏度，使其適用于代謝組學(xué)的分析，推動(dòng)了代謝組學(xué)的發(fā)展。

Harder等[6]建立了一種用HFBA作為離子對(duì)試劑的反相離子對(duì)色譜方法，可以定量分析血漿中22種氨基酸，所有氨基酸的定量限均達(dá)到1 μmol·L-1。在氨基酸分析過程中，樣品前處理和離子對(duì)色譜分離的結(jié)合有效地避免了離子抑制和共流出等缺陷，很適合具有成本效益的大量樣品臨床研究和代謝組學(xué)研究的高通量分析。

李鵬飛等[17]建立了一種同時(shí)定量分析人體中42種氨基酸的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。其流動(dòng)相中含有0.01%的HFBA，采用梯度洗脫，42種氨基酸均能分離。檢測(cè)的氨基酸涉及尿素循環(huán)、鳥氨酸循環(huán)、神經(jīng)內(nèi)分泌代謝、氨能量代謝、硫代謝、運(yùn)動(dòng)代謝組學(xué)等多個(gè)代謝組學(xué)系統(tǒng)，可為氨基酸代謝組學(xué)分析研究提供技術(shù)支持和參考。

3.2臨床檢驗(yàn)中的生物標(biāo)志物

氨基酸在代謝過程中具有重要生理功能，是某些疾病的生物標(biāo)志物，對(duì)它的分析可以應(yīng)用于臨床診斷及藥物的評(píng)價(jià)中[18]。

Qu等[19]研究了使用揮發(fā)性離子對(duì)液相色譜和穩(wěn)定同位素串聯(lián)質(zhì)譜法在生物樣品中定量分析未衍生化氨基酸的方法。該法使用TDFHA和TFA作為流動(dòng)相添加劑，實(shí)現(xiàn)22種未衍生氨基酸在36 min內(nèi)完全分離。其檢測(cè)22種氨基酸的平均回收率為91%～105%，比OPA衍生HPLC法的79%～94%高，是一種簡(jiǎn)單且準(zhǔn)確的定量檢測(cè)生物樣本中未衍生氨基酸的分析方法，可用于新生兒篩查苯丙酮尿癥（PKU）。該技術(shù)在復(fù)雜基質(zhì)中的氨基酸及其類似物的常規(guī)測(cè)定中有很大潛力。

Waterval等[20]使用含有0.5 mmol·L-1的TDFHA水溶液和乙腈作為流動(dòng)相，采用ESI正離子模式，建立了一種應(yīng)用于定量分析血漿和尿液中氨基酸的電噴霧電離超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLCMS/MS）。該法20種氨基酸的線性R2＞0.99，回收率均達(dá)到100%±10%。分析周期30 min，可以快速、可靠的測(cè)定體液中的氨基酸，適合于診斷IEM。

4　展望

提高分析效率和探索更多的通用型檢測(cè)器分析方法，將成為離子對(duì)色譜技術(shù)分析氨基酸的發(fā)展方向，例如使用超高壓液相（UPLC）[20]、采用多檢測(cè)器聯(lián)用，以及探索不需梯度洗脫方法分離，以便使用安培檢測(cè)器、光熱檢測(cè)器、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器、電導(dǎo)檢測(cè)器、密度檢測(cè)器以及示波檢測(cè)器分析氨基酸，改善和開發(fā)新的離子源[5]等?？梢越鉀Q諸如ELSD的靈敏度不高、全氟羧酸對(duì)質(zhì)譜的分析檢測(cè)有不良影響等的局限性，勢(shì)必使得離子對(duì)色譜分析技術(shù)具有更加廣泛的應(yīng)用前景。

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* *通訊作者李博，男，副教授E-mail:libocpu@hotmail.com王歲樓，男，教授E-mail:cpuwsl@126.com

中圖分類號(hào)R917

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1673-7806（2014）05-433-04

*基金項(xiàng)目國(guó)家自然科學(xué)基金（項(xiàng)目編號(hào)8120249）

作者簡(jiǎn)介孫月，女，碩士E-mail:bolepang@126.com

收稿日期2014-04-09修回日期2014-06-10

Application of Ion Pair Chromatography in Amino acid Analysis*

SUN Yue1,2,LI Bo1,2**,HUANG Jie3,WANG Sui-lou1**
1Department of Pharmacy,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009,China;2MOE Key Laboratory of Drug Quality Control and Pharmacovigilance,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009,China;3Gansu Institute for Food and Drug Control,Lanzhou 730070,China

ABSTRACTAmino acids analysis is an important issue tofood,pharmacy,and clinical diagnosis.Ion pair chromatography analysis(IPC)technology has the advantages of simple operation and high sensitivity,and the impurities of deriving can be avoided.The working principles,the factors and the characteristics of using perfluorinated carboxylic acids as ion pair reagent are described.This article emphasizes the research advances in amino acids analysis of food,pharmacy,and clinical diagnosis with IPC technology,and the application prospects of this technology are reviewed.

KEY WORDSAmino acids analysis;Ion Pair Chromatography analysis;Application