血液制品病毒滅活/去除方法概述

遲妍妍，王 斐，張 惠，臧恒昌

(1.山東大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012;2.山東泰邦生物制品有限公司，山東 泰安 271000;3.北京凱元盛世科技發(fā)展有限責(zé)任公司，山東 濟(jì)南 250012)

血液制品［1］是指各種人血漿蛋白制品，包括人血白蛋白、靜脈注射用人免疫球蛋白、人凝血因子、人凝血酶原復(fù)合物等，是臨床上廣泛使用的一類重要的生物制品。血液制品原料是人類血漿，而目前已知經(jīng)血液制品傳染的病毒［2］主要有人類免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、人體T細(xì)胞白血病病毒(HTLV)和細(xì)小病毒B19等。為保證血液制品安全性，主要采取三個(gè)有效措施［2，3］:①對(duì)獻(xiàn)血者的精密篩選，確保血源的安全性;②對(duì)每人份血液/血漿進(jìn)行病毒的系統(tǒng)檢測(cè);③生產(chǎn)過程中進(jìn)行的有效的病毒滅活/去除。因此，為提高血液制品安全性，病毒滅活/去除方法［4］的選擇具有重要意義。

1 化學(xué)法

1.1 有機(jī)溶劑/表面活性劑(S/D)法 早在20世紀(jì)80年代中期S/D法開始發(fā)展應(yīng)用，目前依然是血液制品中一種核心的病毒滅活方法。此方法的基本原理是:有機(jī)溶劑和非離子表面活性劑的混合物能夠破壞脂包膜病毒的類脂膜，從而使類脂從病毒表面脫落，使病毒失去黏附和感染細(xì)胞的能力。Roberts［5］對(duì)S/D法用于高純度的凝血因子進(jìn)行病毒滅活的有效性進(jìn)行了詳盡的考察。結(jié)果顯示，以0.3%的TNBP和1%的Triton－X100為S/D試劑，在22℃條件下處理30min后可以對(duì)凝血因子制品中的牛痘病毒、單純皰疹病毒、辛德畢斯病毒等模擬脂包膜病毒進(jìn)行有效的滅活，證實(shí)了S/D法用于脂包膜病毒滅活的穩(wěn)健性和有效性。S/D法主要用于凝血因子制品、蛋白酶抑制劑、人免疫球蛋白等血液制品的脂包膜病毒的滅活。

1.2 低pH孵放法 低pH孵放在20世紀(jì)80年代初用于注射用人免疫球蛋白的制備過程中防止免疫球蛋白的聚合，隨后發(fā)現(xiàn)其對(duì)大部分的脂包膜病毒有滅活作用，后被用于血液制品的病毒滅活。滅活機(jī)理是:在pH 4，溫度30～37℃條件下保溫超過20 h，某些病毒成分產(chǎn)生變質(zhì)，從而影響病毒的復(fù)制，最終使病毒失去傳染性。Roberts等［6］對(duì)孵放法進(jìn)行了考察，研究表明，在pH 5、30℃條件下對(duì)靜脈注射用免疫球蛋白持續(xù)處理14 d能夠?qū)χげ《竞筒糠址前げ《具M(jìn)行有效的滅活。證實(shí)了該方法可以作為生產(chǎn)過程的終端處理，和S/D法、離子交換層析法結(jié)合共同用于注射用免疫球蛋白的病毒滅活，保證免疫球蛋白產(chǎn)品的安全性。該方法要求蛋白質(zhì)產(chǎn)品的活性在低pH條件下保持穩(wěn)定，因此一般只用于免疫球蛋白脂包膜病毒的滅活。

1.3 辛酸處理法 早在20世紀(jì)90年代初，Lundblad等［7］報(bào)道了辛酸鈉滅活4種脂包膜蛋白的機(jī)制，揭開了辛酸法在病毒滅活中的應(yīng)用。此法是在低pH條件下，辛酸的非離子形式具有親脂性，能夠進(jìn)入病毒脂包膜從而破壞脂質(zhì)雙分子層和相關(guān)蛋白質(zhì)的完整性，使脂包膜病毒失去傳染性，達(dá)到脂包膜病毒的滅活作用。Dichtelmüller等［8］以3批注射用免疫球蛋白制劑作為研究對(duì)象，對(duì)辛酸法用于免疫球蛋白溶液病毒滅活的有效性進(jìn)行了考察。結(jié)果顯示，7.45 g·kg－1的辛酸溶液能夠在極短的時(shí)間(1min)內(nèi)對(duì)人免疫缺陷病毒、牛病毒性腹瀉病毒、辛德畢斯病毒、偽狂犬病病毒進(jìn)行有效的滅活。由于辛酸法需要在低pH(通常pH＜6)條件下發(fā)揮作用，要求蛋白質(zhì)產(chǎn)品在低pH條件下能夠保持其穩(wěn)定性，因此目前主要用于免疫球蛋白M和免疫球蛋白G的病毒滅活。

1.4 光化學(xué)法 亞甲藍(lán)(MB)/可見光處理法、補(bǔ)骨脂素/UVA處理法、核黃素/UV處理法等是目前常用的光化學(xué)方法［9］，主要用于全血漿以及血小板制品的病毒滅活。

MB/可見光法病毒滅活的原理［10］是:MB是一種帶正電荷的感光吩噻嗪染劑，可以穿過病毒的包膜與核酸結(jié)合，在一定強(qiáng)度的光照射下發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生羥基自由基和單態(tài)氧，阻止核酸的復(fù)制從而達(dá)到病毒滅活的目的。此法對(duì)脂包膜病毒有良好的滅活效果，對(duì)非包膜病毒滅活效果不理想。此外，對(duì)于不穩(wěn)定的蛋白產(chǎn)品可能造成功能活性的損失，目前多有文獻(xiàn)報(bào)道［11］此病毒滅活方法對(duì)于血漿蛋白的影響變化。

補(bǔ)骨脂素/UVA法病毒滅活的原理［12］是:補(bǔ)骨脂素分子能夠可逆的嵌入DNA、RNA螺旋中，在長波紫外線(UVB)的照射下，補(bǔ)骨脂素分子與嘧啶堿基相互作用，阻止病毒的復(fù)制，使其失去傳染性。此方法的病毒滅活效果以及缺陷與MB/可見光法相似。

核黃素/UV法的原理［13］是:核黃素是小分子物質(zhì)，能夠插入核酸內(nèi)部，在UV的作用下，通過可逆性氧化還原反應(yīng)轉(zhuǎn)移電子，使鳥嘌呤氧化，病毒無法復(fù)制從而使其失去傳染性。此法對(duì)脂包膜病毒以及一些非包膜病毒的滅活作用效果顯著，但是也容易造成不穩(wěn)定蛋白的失活。

2 物理法

2.1 巴氏消毒法 巴氏消毒法是在60℃條件下對(duì)蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行連續(xù)加熱至少10 h，使病毒蛋白變性，從而抑制病毒遺傳物質(zhì)的復(fù)制，最終使病毒失去傳染性。Chandra等［14］通過相關(guān)文獻(xiàn)的檢索對(duì)巴氏消毒法進(jìn)行了詳細(xì)的綜述，結(jié)果表明巴氏消毒法只需要控制很少的過程參數(shù)，滅毒過程容易被監(jiān)測(cè)，對(duì)脂包膜病毒和非包膜病毒均有滅活作用，滅毒范圍廣。作為一種傳統(tǒng)成熟的病毒滅活方法，巴氏消毒法可以用于白蛋白、凝血因子、免疫球蛋白、蛋白酶抑制劑等血液制品的脂包膜和非包膜病毒的滅活。雖然巴氏消毒法目前已成為一種廣泛的血液制品病毒滅活方法，但同時(shí)存在著一些局限性:①蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑的加入降低了病毒滅活的能力;②細(xì)小病毒B19有耐熱性，不利于該病毒的滅活;③在熱條件處理下會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)產(chǎn)品的變性，使產(chǎn)品的活性降低，因此不能用于穩(wěn)定性不好的血漿蛋白的病毒滅活。

2.2 干熱處理法 干熱法最早于20世紀(jì)80年代初被用于凝血因子制品中肝炎病毒的滅活，1984年，干熱法被批準(zhǔn)用于HIV的滅活。其原理是:制劑凍干后加熱處理，使病毒復(fù)制所需要的分子和結(jié)構(gòu)改變，從而抑制其復(fù)制過程。干熱法常用的處理?xiàng)l件有60℃、96 h，80℃、72 h以及100℃、30min。Seop等［15］通過對(duì)凍干后的凝血因子進(jìn)行干熱法病毒滅活的研究發(fā)現(xiàn)，在100℃、30min的處理?xiàng)l件下，此病毒滅活方法除了對(duì)豬細(xì)小病毒的滅活不理想外，對(duì)其他病毒均有良好的滅活效果，而且經(jīng)過此方法后凝血因子的失活僅在5%左右，沒有發(fā)現(xiàn)蛋白制品的物理或生物學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化，證明了干熱法作為最終病毒滅活的關(guān)鍵步驟，能夠保證凝血因子產(chǎn)品的病毒安全性。由于對(duì)病毒滅活能力的限制，此方法常用于凝血因子制品的輔助病毒滅活方法。

3 病毒去除方法

3.1 納米膜過濾［4］納米膜過濾病毒去除技術(shù)是使用15～45 nm之間的濾膜對(duì)血液制品溶液進(jìn)行過濾，利用篩分原理，在納米膜過濾中，大于濾膜孔徑的病毒或其他病原體被截留在薄膜上，尺寸較小的蛋白產(chǎn)品則能通過濾膜繼續(xù)存留在溶液中。繼20世紀(jì)90年代初中期被引進(jìn)用于病毒去除以來，納米膜過濾技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為一種廣為接受的穩(wěn)定可靠的病毒去除方法，并且用于除了白蛋白制品之外的其他血液制品的病毒去除過程。Caballero等［16］考察了巴氏消毒法結(jié)合納米膜過濾去除病毒的有效性，以豬細(xì)小病毒作為模擬病毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過孔徑為20 nm的納米濾膜后病毒滴度下降＞4log，證實(shí)了納米膜過濾結(jié)合巴氏消毒法和S/D法用于一種新的免疫球蛋白制品病毒去除的有效性。納米膜過濾法能夠有效去除非包膜病毒以及其他難以滅活的致病病原體，提高了目標(biāo)蛋白產(chǎn)品的安全性，并且蛋白生物活性回收率能夠達(dá)到90%～95%。

3.2 其他方法 蛋白產(chǎn)品的制備過程中常包含有沉淀步驟，同時(shí)也有病毒去除的作用。在冷乙醇沉淀過程中，各種病毒可能被分離至廢棄組分中，蛋白純化的同時(shí)進(jìn)行部分病毒的移除。深度過濾是一種重要的蛋白純化手段，濾材會(huì)對(duì)部分病毒產(chǎn)生吸附，從而去除病毒。層析技術(shù)是目前迅速發(fā)展的一種蛋白純化方法，在純化過程中蛋白產(chǎn)品被吸附在層析柱而病毒存在于流動(dòng)相中，在蛋白純化的同時(shí)進(jìn)行病毒的去除。Roberts等［6］經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，靜脈注射用免疫球蛋白產(chǎn)品經(jīng)離子交換層析過程后，1型單純皰疹病毒和牛乳頭狀瘤病毒的滴度下降＞5log，能夠?qū)Σ《居行У娜コ?，?duì)其他模擬病毒雖有一定的去除作用，但是不能達(dá)到有效的移除。

以上冷乙醇沉淀、深度過濾、層析等都是蛋白產(chǎn)品的生產(chǎn)過程，同時(shí)也具有病毒移除的作用。但是這些過程對(duì)病毒的移除能力有限，因此只能作為一種輔助的手段。

4 結(jié)語

綜上所述，目前化學(xué)法中的S/D法、低pH孵放法、辛酸法、光化學(xué)法，物理法中的巴氏消毒法和干熱法等是血液制品制備過程中核心的病毒滅活方法。此外，納米膜過濾、冷乙醇沉淀過程、深度過濾、層析法等方法雖然不能保證去除所有的病毒，但是和核心的病毒滅活方法相結(jié)合，共同保證病毒的徹底滅活/去除，保證血液制品的安全性。如今，血液制品安全性的保證是主要目的，而病毒的有效滅活/去除的環(huán)節(jié)至關(guān)重要。由于單一病毒滅活/去除方式的局限性，存在對(duì)有些病毒(尤其是非包膜病毒)不能完全的去除的可能性，因此目前生產(chǎn)過程中一般采用兩種或兩種以上的病毒滅活/去除方法以保證血液制品的安全性。為更好地達(dá)到病毒滅活/去除的目的，更有效、安全的方式也在不斷研究與開發(fā)中，不同方式的有機(jī)結(jié)合也將是新的發(fā)展方向。

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